【摘要】：研究背景： 脆性X綜合征[fragileⅩsyndrome, Fra (Ⅹ)]是最常見的遺傳性智力低下性疾病之一。據(jù)保守估計(jì),我國至少有20萬脆性X病人,由于病人壽命正常,而智力低下,沒有獨(dú)立生活的能力,因此對家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。 目前認(rèn)為Fra(Ⅹ)致病機(jī)制主要是脆性x智力低下一號基因(fragileⅩmental retardation-1 gne, FMR1)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)存在(CGG) n三核苷酸重復(fù)序列的不穩(wěn)定擴(kuò)增及其上游的CpG島的異常甲基化,這些突變使FMR1基因轉(zhuǎn)錄受到抑制,導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物脆性X智力低下蛋白(fragileⅩmental retardation protein,FMRP)減少或缺如,最終表現(xiàn)為Fra (Ⅹ)。目前認(rèn)為,CpG島有無異常甲基化比CGG重復(fù)數(shù)對表型的影響更為重要。Pietrobono R發(fā)現(xiàn)在無DNA甲基化的情況下,CGG重復(fù)序列的擴(kuò)增本身并不阻止FMR1的翻譯以及FMRP的產(chǎn)生。已有病例報(bào)道,患者FMR1基因(CGG)n已擴(kuò)增至完全突變,但由于CpG島未甲基化,FMRP仍能正常表達(dá),所以智力表現(xiàn)正常。從而提示有無甲基化也許是使FMR1基因轉(zhuǎn)錄沉默和相應(yīng)蛋白表達(dá)缺如的主要原因。 FMRP的減少或缺如,最終表現(xiàn)為脆性X綜合征。FMRP是RNA結(jié)合蛋白,可通過轉(zhuǎn)運(yùn)靶RNA對轉(zhuǎn)錄水平的剪切,RNA轉(zhuǎn)運(yùn),mRNA穩(wěn)定及翻譯水平起重要調(diào)節(jié)作用。許多研究都提示FMRP通過對調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和蛋白質(zhì)的合成來影響突觸的形成和功能。在樹突棘F(xiàn)MRP調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成,影響突觸發(fā)育和腦的可塑性。在突觸內(nèi),若FMRP缺乏,一些蛋白則過度翻譯,導(dǎo)致與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的長時(shí)程抑制的增強(qiáng)(LTP)。從而最終引起智力低下和行為問題。另診斷方面也均認(rèn)為檢測FMRP表達(dá)率比DNA檢測更能反映患者智力低下的水平�？傊瓼MRP的研究對Fra (Ⅹ)的發(fā)病機(jī)制,臨床診斷及治療的研究至關(guān)重要。 Hwu等研究發(fā)現(xiàn),FMR1基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)具有增強(qiáng)子活性的甲基化敏感區(qū)(MSE),與FMR1基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。該MSE與cAMP反應(yīng)單位(CRE)堿基序列重疊,而CRE序列是環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(CREB)的結(jié)合位點(diǎn)。CREB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,具有調(diào)節(jié)包括記憶功能在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能,是長期記憶形成過程所必需的一種普遍存在的調(diào)節(jié)分子。另研究發(fā)現(xiàn)Fra (Ⅹ)患者以及體外模型FMR1基因封閉后細(xì)胞內(nèi)cAMP水平均下降,且FMR1基因(CGG) n三核苷酸片段擴(kuò)增大小與cAMP含量呈負(fù)相關(guān),隨著FMR1的編碼蛋白——脆性X智力低下蛋白的表達(dá)增加,細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)量明顯增加。以上資料提示,FMR1基因、FMRP和cAMP二者之間可能存在相互調(diào)控關(guān)系。 我們前期研究了FMR1基因被甲基化封閉后對cAMP代謝過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶,即：腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)及磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FMR1基因封閉后細(xì)胞內(nèi)cAMP水平下降,在FMR1基因封閉組腺苷酸環(huán)化酶活性明顯降低,而磷酸二酯酶的活性無顯著差異。由此,提出FMR1基因的功能缺陷可影響腺苷酸環(huán)化酶的活性,腺苷酸環(huán)化酶活性抑制可能是影響Fra (Ⅹ)患者細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低的主要原因。假如采用藥物提高腺苷酸環(huán)化酶的活性,改善FMR1基因細(xì)胞內(nèi)cAMP的低水平狀態(tài),是否能誘導(dǎo)沉默F(xiàn)MR1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)呢? 本研究試圖在被甲基化封閉的FMR1基因細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,探討特異性腺苷酸環(huán)化酶(AC)激活劑—弗司可林(forskolin, FSK) (?)秀導(dǎo)沉默F(xiàn)MR1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的可能性及其效果；并構(gòu)建FMR1啟動(dòng)子區(qū)MSE/CRE熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),為進(jìn)一步研究AC激動(dòng)劑重啟FMR1基因的機(jī)制,以及AC激動(dòng)劑活化CRE序列與啟動(dòng)子甲基化的關(guān)系奠定基礎(chǔ),可望為該病的治療提供新的思路和治療方法。 研究方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)：K-562及Hela細(xì)胞均用RPMI-1640完全培養(yǎng)液加10%的新生牛血清培養(yǎng),細(xì)胞在溫度37℃和5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng),2-3天更換一次培養(yǎng)基。加硝普鈉后的細(xì)胞培養(yǎng)均避光培養(yǎng)。 2、制作K-562細(xì)胞FMR1基因封閉的細(xì)胞模型：采用如下原理制造模型,即：硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP)為經(jīng)典的一氧化氮(nitric oxide, NO)供體,通過可產(chǎn)生的NO活化DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA MeTase),使FMR1啟動(dòng)子區(qū)CpG島的MSE中的胞嘧啶發(fā)生高度甲基化,從而阻斷了核酸因子與啟動(dòng)子的結(jié)合,抑制了FMR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄。 2.1SNP濃度選取：應(yīng)用普通及Taqman熒光定量PCR觀察FMR1基因的封閉效果,據(jù)文獻(xiàn)分為正常組、SNP500umol/L組、SNP800umol/L組、SNP1000umol/L組(分別加入對應(yīng)終濃度的SNP),培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞,據(jù)結(jié)果選取最佳濃度。 2.2驗(yàn)證SNP在mRNA水平封閉FMR1基因的效果：同上應(yīng)用兩種PCR法觀察FMR1基因的封閉效果,分別設(shè)6個(gè)時(shí)間點(diǎn){12h、24h、48h、72h、96h、96h (72h更換SNP后)}觀察一次性加入SNP后封閉持續(xù)的時(shí)間,及換液后是否有持續(xù)封閉效果。 2.3觀察SNP對蛋白水平FMRP表達(dá)的影響：應(yīng)用western blot方法,分別取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)觀察FMRP的表達(dá)情況。 3、觀察腺苷酸環(huán)化酶激活劑(FSK)對FMR1封閉基因mRNA水平重啟的效果：采用SNP1000umol/L封閉基因,于培養(yǎng)24h后加入FSK(終濃度50μmol/L),分別于12h、24h、48h、72h收集細(xì)胞,并設(shè)正常對照組,應(yīng)用上述兩種PCR方法觀察FMR1基因的封閉后重啟效果。 4、觀察腺苷酸環(huán)化酶激活劑(FSK)重啟FMR1封閉基因后對FMRP表達(dá)的影響：用western blot方法,于SNP1000umol/L于培養(yǎng)24h后加FSK(終濃度50μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)至72h之后收集細(xì)胞,觀察FMRP的表達(dá)情況。 5、熒光素酶載體的構(gòu)建 5.1. FMR1基因啟動(dòng)子區(qū)MSE/CRE重疊片段的釣�。喊磘akala質(zhì)粒提取試劑盒說明書常規(guī)提取基因組DNA,用PCR法擴(kuò)增啟動(dòng)子片段。后將PCR產(chǎn)物與T載體相連,并提取質(zhì)粒T-MSE,測序驗(yàn)證。 5.2表達(dá)載體構(gòu)建： 以T-MSE為模板,應(yīng)用PCR法獲得帶有酶切位點(diǎn)kpnⅠ和hindⅢ的野生啟動(dòng)子片段,并提取質(zhì)粒,之后同PGL-4載體質(zhì)粒一起用限制性內(nèi)切酶kpnⅠ和hindⅢ進(jìn)行酶切,經(jīng)PCR、雙酶切及測序驗(yàn)證后,進(jìn)行連接構(gòu)建表達(dá)載體。 6、熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)熒光素酶活性檢測 6.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對數(shù)生長期的hela細(xì)胞以105每孔的濃度鋪24孔板,根據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書配置轉(zhuǎn)染混合物(24孔板每孔量)：PGL-4/MSE啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒或PGL-4 Basic 5ul+海腎質(zhì)粒0.5ul+lipo2000 3.5ul,并進(jìn)行共轉(zhuǎn),后繼續(xù)培養(yǎng)。 6.2相對熒光素酶活性檢測： 收集上述細(xì)胞參照Dual-Luciferase Reporter Assay試劑盒說明測定熒光素酶活性。 上述實(shí)驗(yàn)均相同條件下,重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,除FMRP表達(dá)量的數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)+極差(M+R)表示外,其他數(shù)據(jù)均用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(X+SD)表示；熒光定量PCR結(jié)果的采用2-△△CT值分析,除SNP時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)不符合方差齊性組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallistest,多重比較采用Bonferroni法外,其他均采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的One-Way ANOVA,多重比較采用SLD法；Western blot數(shù)據(jù)是采用Bia-Rad軟件分析得的Density ratio,即A值分析,由于不符正態(tài)分布,組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis test,多重比較采用Bonferroni法；相對熒光素酶活性檢測數(shù)據(jù)應(yīng)用相對熒光素酶活性強(qiáng)度值分析,組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；以上均取P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1、成功制作K-562細(xì)胞FMR1基因封閉的細(xì)胞模型 1.1 SNP在500、800、1000μmol/L濃度時(shí),均有一定封閉效果(F=105.423,P0.001),其FMR1基因的表達(dá)量分別下降到處理前的0.063、0.017、0.006倍,可見SNP1000μmol/L時(shí)封閉效果最明顯(P0.001),且一次加入封閉效果可持續(xù)到96H,于72h換液繼續(xù)培養(yǎng)后可達(dá)持續(xù)封閉效果。 1.2 SNP封閉FMR1基因后對蛋白水平FMRP表達(dá)的影響：SNP封閉FMR1 24h, 48h,72h后,FMRP的表達(dá)量依次下降,提示SNP封閉FMR1基因后可使FMRP的表達(dá)明顯受抑(H=12.833,P=0.012)。 2、FSK對FMR1封閉基因mRNA水平重啟的效果： FSK可于24H時(shí)(F=34.921,P0.001；P0.001)重啟封閉后的FMR1基因,使其表達(dá)量升至對照組的0.133倍,并持續(xù)到48H(F=34.921,P0.001; P0.001),此時(shí)其表達(dá)量是對照組的0.138倍。 3、FSK重啟FMR1封閉基因后對FMRP表達(dá)的影響：FSK可使表達(dá)明顯受抑的FMRP重新表達(dá)(H=12.833, P=0.012; P=1.00),72h后FMRP的表達(dá)量幾乎與對照組相當(dāng)。 4、熒光素酶載體構(gòu)建：步驟中所有序列(MSE序列、加酶切位點(diǎn)后的MSE序列)測序正確,構(gòu)建成功的載體經(jīng)初步鑒定、PCR法、雙酶切法及測序驗(yàn)證均成功。 5、熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)熒光素酶活性檢測：PGL-4/MSE質(zhì)粒與海腎質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞后,所測得熒光素酶活性強(qiáng)度值分析,與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,顯示質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入hela細(xì)胞。表明以MSE/CRE重疊序列為研究對象的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)構(gòu)建成功。 研究結(jié)論： 1.成功制作了K-562細(xì)胞FMR1基因封閉的細(xì)胞模型,可使封閉后FMRl基因最低表達(dá)量降至處理前的0.006倍,FMRP的表達(dá)量降至處理前0.477倍,驗(yàn)證了此方法制造Fra (Ⅹ)細(xì)胞模型的可行性。 2.證實(shí)FSK可在mRNA水平重啟甲基化封閉的FMR1基因,其基因表達(dá)量可達(dá)對照組的0.138倍,且可持續(xù)到48小時(shí)；發(fā)現(xiàn)用藥72小時(shí)后FMRP蛋白表達(dá)量可接近正常組水平；提示特異性腺苷酸環(huán)化酶激活劑可有效地誘導(dǎo)甲基化封閉的FMR1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),可望為Fra (Ⅹ)的治療提供新的思路和治療前景。 3.成功構(gòu)建了MSE/CRE重疊序列/PGL-4雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),為進(jìn)一步研究AC激動(dòng)劑重啟FMR1基因的機(jī)制,以及AC激動(dòng)劑活化CRE序列與啟動(dòng)子甲基化的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

瓊脂糖電泳圖、熒光定量擴(kuò)增曲線圖及數(shù)據(jù)表:l一1不同濃度SNP對人K一562細(xì)胞FMRImRNA表達(dá)的影響(X+effectdifferenteoneentrationsofSNponFMRImRNAexPression

第一章腺普酸環(huán)化酶激活劑誘導(dǎo)脆性X智力低下一號基因重新開啟及蛋白表達(dá)的研究4、WESTERNBLOT圖及數(shù)據(jù)表1一4SNP及FSK對FMRP表達(dá)的影響(M+R)Tablel一4TheeffectofSNPandFSKonFMRpexPression(M土R)grOUP正常組SNP24SNP48SNP72FSK72nDensityratio1.009+0.10.7919+0.050.6939+0.060.4750+0.030.9958+0.04平均秩次12.338.005.002.0012.6712.833P0.01233，Jon注:數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，故采用Kruskal一wallistest，，多重比較采用Bonferroni法，SNp24、SNP48、SNP72及FSK72組與正常組相比P值非別為(0.001、(0.001、<0.001及1.000
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R749.94

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2611533