【摘要】： 目的 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,AD臨床上表現(xiàn)為不可逆進(jìn)行性發(fā)展的記憶減退、認(rèn)知、語言障礙及人格的改變等。大量研究發(fā)現(xiàn),AD的主要病理特征是全腦萎縮,腦細(xì)胞外出現(xiàn)大量的老年斑(senile plaque,SP),細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT),以及以海馬皮層區(qū)域?yàn)橹鞯纳窠?jīng)元大量丟失。β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)是老年斑的主要成分,且Aβ已經(jīng)成為AD發(fā)病過程中的一個(gè)重要因素。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示了Aβ可以直接引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和死亡,但Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制是復(fù)雜的。近年來的研究發(fā)現(xiàn),Aβ可以通過多種不同的途徑誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生,產(chǎn)生過多的自由基,引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。已有研究顯示,氧化應(yīng)激反應(yīng)可以通過一系列的分子機(jī)制引起和促進(jìn)神經(jīng)元變性并導(dǎo)致神經(jīng)元丟失,這在Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性過程中起到重要作用。Aβ通過氧化應(yīng)激反應(yīng)生成大量的活性氧進(jìn)一步增加細(xì)胞的易損性,從而增加了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 親環(huán)素A(cyclophilin A,CyPA)是親環(huán)素家族成員之一,具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIase)活性,它的分子量為18000,也稱CyP18。CyPA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,也可出現(xiàn)在細(xì)胞核以及細(xì)胞外。它是一種高度保守的蛋白質(zhì),從低等原核生物到哺乳動物都有這種蛋白,并且廣泛分布于許多組織。在腦組織中CyPA高度表達(dá),主要定位于神經(jīng)元。它參與神經(jīng)元分化以及成年皮質(zhì)可塑性,同時(shí)過表達(dá)CyPA可以增加人胚胎腦細(xì)胞的生長率。近年來研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)細(xì)胞以及其他組織細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激以及缺血缺氧等損傷時(shí),細(xì)胞內(nèi)的CyPA表達(dá)明顯升高。此外,細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)CyPA以及應(yīng)用外源性的CyPA可以保護(hù)神經(jīng)元抵抗氧化應(yīng)激以及缺血缺氧等損傷,而降低了細(xì)胞內(nèi)CyPA的表達(dá)使細(xì)胞更易遭受有害物質(zhì)的損傷。由此可見,一方面,細(xì)胞損傷后CyPA表達(dá)升高是一種內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制,參與細(xì)胞損傷的應(yīng)答;另一方面,過表達(dá)CyPA以及外源性的CypA可以保護(hù)細(xì)胞,抵抗氧化應(yīng)激等不良因素造成的損傷,也說明CyPA具有抗氧化的作用。 本研究應(yīng)用Aβ_(25-35)注入大鼠雙側(cè)海馬組織建立AD的動物模型以及應(yīng)用Aβ_(25-35)干預(yù)PC12細(xì)胞建立細(xì)胞模型并用CypA進(jìn)行預(yù)處理。一方面觀察Aβ_(25-35)注入大鼠海馬組織后,所引起的大鼠海馬組織的形態(tài)和CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的變化和細(xì)胞凋亡情況,并觀察海馬組織中CypA的mRNA和蛋白表達(dá)的變化;另一方面觀察CyPA對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的存活率、細(xì)胞形態(tài)和凋亡率的影響,以及對線粒體跨膜電位,細(xì)胞內(nèi)ROS水平,細(xì)胞的SOD和GSH-Px的活性、凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和p53及p38MAPK通路的的影響。 方法 動物實(shí)驗(yàn):取健康的Wistar大鼠60只,隨即分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。每組又按注液后1d,7d和14d分為3個(gè)亞組,每組10只。采用雙側(cè)海馬立體定位注射的方法建立動物模型,實(shí)驗(yàn)組每側(cè)海馬注射2μl(10μg)Aβ_(25-35)(Aβ_(25-35)臨用前于37℃放置2d使其凝聚),對照組在海馬內(nèi)注射等量的生理鹽水。取各個(gè)組其中5只大鼠,于注射后1d,7d和14d相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),進(jìn)行腦灌流固定,分別進(jìn)行HE染色,Nissel染色和TUNEL染色。取各個(gè)組另外5只大鼠,于注射后1d,7d和14d相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),快速取出大腦,分離雙側(cè)海馬組織,-70℃冰箱保存待進(jìn)行CyPA的PT-PCR和Western Blot檢測。 培養(yǎng)細(xì)胞:將培養(yǎng)的PC12細(xì)胞,用不同終濃度的CyPA(0.1、1、10和100nmol/L)處理30min,再加入10μmol/L的Aβ_(25-35)(Aβ_(25-35)臨用前于37℃放置2d使其凝聚)繼續(xù)培養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)均分為正常對照組(0μmol/L Aβ_(25-35))、處理組(10μmol/L Aβ_(25-35))和藥物保護(hù)組(CyPA+Aβ_(25-35))。加入Aβ_(25-35)48小時(shí)后,各組采用MTT法檢測細(xì)胞的存活率,HE染色觀察細(xì)胞形態(tài),PI單染后流式細(xì)胞儀檢測凋亡,Hoechst33258熒光染色觀察凋亡,RT-PCR和Western Blot的方法檢測Bcl-2、Bax和p53基因的mRNA和蛋白的表達(dá)。加入Aβ_(25-35)24小時(shí)后,各組采用Rh123熒光染色觀察線粒體跨膜電位改變并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析,采用DCF-DA熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的水平并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析,檢測細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性,以及Western Blot檢測p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表達(dá)觀察p38MAPK通路的活化情況。 結(jié)果 1、大鼠海馬HE染色結(jié)果 對照組各亞組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞帶完整,未見明顯的神經(jīng)元缺失,細(xì)胞排列有序,未見明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞增生。實(shí)驗(yàn)組1d亞組大鼠海馬CA1區(qū)較對照組神經(jīng)細(xì)胞略減少,細(xì)胞排列略有改變;實(shí)驗(yàn)組7d亞組大鼠海馬CA1區(qū)較對照組神經(jīng)細(xì)胞減少明顯,細(xì)胞排列紊亂;實(shí)驗(yàn)組14d亞組大鼠較7d亞組上述表現(xiàn)更為明顯。 2、大鼠海馬Nissel染色結(jié)果 對照組各亞組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞帶無明顯受損,神經(jīng)細(xì)胞密集,排列完整。實(shí)驗(yàn)組1d亞組大鼠海馬CA1區(qū)較對照組神經(jīng)細(xì)胞排列不整齊,細(xì)胞有所減少;實(shí)驗(yàn)組7d亞組大鼠海馬CA1區(qū)較對照組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞帶結(jié)構(gòu)喪失,細(xì)胞減少明顯;實(shí)驗(yàn)組14d亞組大鼠較7d亞組上述表現(xiàn)更為明顯。 3、大鼠海馬TUNEL染色結(jié)果 對照組各亞組大鼠海馬CA1區(qū)幾乎未見TUNEL染色陽性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組1d亞組凋亡細(xì)胞數(shù)較少,實(shí)驗(yàn)組7d,14d亞組凋亡細(xì)胞明顯增多,且隨時(shí)間延長,凋亡數(shù)逐漸增多,3個(gè)亞組凋亡細(xì)胞較對照組均有顯著性差異。 4、大鼠海馬CyPA的mRNA和蛋白的表達(dá)情況 對照組各亞組大鼠海馬均有CyPA的mRNA和蛋白的表達(dá),各組之間沒有明顯差異。實(shí)驗(yàn)組1d亞組的CyPA的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增高與對照組相比具有顯著性差異;實(shí)驗(yàn)組7d亞組的CyPAmRNA和蛋白的表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組1d亞組有所下降,但是仍然高于對照組,與對照組相比具有顯著性差異;實(shí)驗(yàn)組14d亞組的CyPA的mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)一步下降,且低于對照組,CyPA的mRNA的表達(dá)較對照組沒有顯著差異,但是蛋白的表達(dá)較對照組有顯著差異。 5、MTT檢測細(xì)胞存活率 Aβ_(25-35)處理組細(xì)胞存活率較正常對照組明顯降低,而藥物保護(hù)組與Aβ_(25-35)處理組相比能明顯提高的細(xì)胞存活率,除0.1nmol/L的CyPA的作用不明顯,其余各組細(xì)胞存活率均明顯提高,具有濃度依賴性。 6、細(xì)胞的HE染色結(jié)果 正常PC12細(xì)胞胞體飽滿,細(xì)胞間聯(lián)系緊密,胞核藍(lán)紫色,Aβ_(25-35)處理組的細(xì)胞數(shù)量減少,胞漿皺縮或飽漲,胞質(zhì)濃縮,核固縮或碎裂,呈藍(lán)黑色,10和100nmol/L的CyPA預(yù)處理組的大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)接近正常。 7、PI單染后流式細(xì)胞儀檢測凋亡的結(jié)果 正常對照組有少量的細(xì)胞凋亡,Aβ_(25-35)處理組細(xì)胞凋亡率明顯增加,藥物保護(hù)組中1、10和100nmol/L的CyPA明顯降低了細(xì)胞的凋亡率,而0.1nmoI/L的CyPA幾乎不起作用。 8、Hoechst33258染色結(jié)果 正常對照組細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻的藍(lán)色熒光;Aβ_(25-35)處理組可見明顯的細(xì)胞凋亡,呈現(xiàn)高亮藍(lán)色濃染致密的顆粒塊狀熒光,細(xì)胞核明顯固縮、凝聚和斷裂;除了0.1nmol/L的CyPA組以外,其余各CyPA預(yù)處理組的凋亡的細(xì)胞明顯減少。 9、線粒體跨膜電位的檢測結(jié)果 Aβ_(25-35)處理組細(xì)胞線粒體跨膜電位較正常對照組明顯降低,表現(xiàn)為細(xì)胞的熒光強(qiáng)度降低,1、10和100nmol/L的CyPA處理組較Aβ_(25-35)處理組明顯提高了細(xì)胞線粒體跨膜電位,而0.1 nmol/L的CyPA作用不顯著。 10、細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測結(jié)果 Aβ_(25-35)處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較正常對照組明顯升高,表現(xiàn)為細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),1、10和100nmol/L的CyPA處理組明顯抑制了Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的增多,而0.1 nmol/L的CyPA不起作用。 11、SOD和GSH-Px活性的檢測結(jié)果 Aβ_(25-35)處理組細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性較正常對照組明顯降低,10和100nmol/L的CyPA處理組明顯提高了細(xì)胞SOD和GSH-Px活性,較Aβ_(25-35)處理組有顯著性差異,1 nmol/L的CyPA處理組SOD活性較Aβ_(25-35)處理組沒有顯著性差異,但是GSH-Px活性較Aβ_(25-35)處理組有顯著性差異,而0.1 nmol/L的CyPA幾乎不起作用。 12、Bcl-2和Bax基因mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果 Aβ_(25-35)處理組Bcl-2基因的mRNA和蛋白表達(dá)較正常對照組明顯減少,Bax基因的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加。除0.1nmol/L的CyPA處理組外,其余各CyPA處理組Bcl-2基因的mRNA和蛋白表達(dá)較Aβ_(25-35)處理組明顯增加,Bax基因的mRNA和蛋白表達(dá)較Aβ_(25-35)處理組明顯減少,呈劑量依賴性。 Aβ_(25-35)處理組Bcl-2和Bax基因mRNA和蛋白比值較正常對照組明顯減低,CyPA處理后,除0.1nmol/L的CyPA處理組外,其余各組的比值均明顯增高,呈劑量依賴性。 13、p53基因的的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果 Aβ_(25-35)處理組p53基因的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加。除0.1nmol/L的CyPA處理組外,其余各CyPA處理組p53基因的mRNA和蛋白表達(dá)較Aβ_(25-35)處理組明顯減少,呈劑量依賴性。 14、p38MAPK通路活化情況 正常對照組未見p38MAPK通路活化,Aβ_(25-35)處理后p38MAPK通路明顯活化,1、10和100nmol/L的CyPA可以抑制Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的p38MAPK通路活化,而0.1 nmol/L的CyPA未見明顯作用。 結(jié)論 1、在大鼠海馬部位立體定位注射Aβ_(25-35)后,引起海馬神經(jīng)元受損并且導(dǎo)致凋亡,隨時(shí)間延長,損傷增強(qiáng)。 2、在大鼠海馬部位立體定位注射Aβ_(25-35)后,引起海馬組織的CyPAmRNA和CyPA蛋白水平表達(dá)改變,早期增加,但隨時(shí)間延長,表達(dá)逐漸減少。 3、CypA可以通過抵抗誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體跨膜電位的降低,ROS生成增加和SOD和GSH-Px的活性降低保護(hù)細(xì)胞,提高PC12細(xì)胞存活率,降低凋亡率。 4、CypA可以通過抵抗Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Bcl-2mRNA和蛋白減低,Bax和p53的mRNA和蛋白減低以及抑制p38MAPK通路的活化參與細(xì)胞保護(hù),減少凋亡。
【圖文】：

1(l7d14d各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CyPAmRNA表達(dá)的變化(相對值)組相比P<0.05七stemBlot檢測ld，7d和14d3個(gè)亞組的大鼠海馬的cyPA蛋白表達(dá)沒有顯著性差組CyPA蛋白表達(dá)明顯高于對照組(尸<0.05);實(shí)驗(yàn)組7d亞組c明顯高于對照組(p<0.05)，但是較實(shí)驗(yàn)組ld亞組cy隊(duì)蛋白表驗(yàn)組14d亞組的cy隊(duì)蛋白表達(dá)低于對照組，，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意見表4，圖8、9。各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CyPA蛋白表達(dá)的變化(相對值)CyPA/p一actin

、洲、‘一、CyPA自踐如喊扣卜!婦峽悶喊戶喊，一:cth、圖8，研觸 stblot對照組ld實(shí)驗(yàn)組ld檢測各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CyPA蛋白的表達(dá)B對照組7dC對照組14dE實(shí)驗(yàn)組7dF實(shí)驗(yàn)組14dDA’ ’’’’’_…一_一….…… … 奏奏奏 奏奏奏奏 奏 蒙蒙蒙 蒙蒙 蒙 蒙蒙蒙蒙 摹 摹 摹摹 摹 摹摹摹摹摹摹田對照組口實(shí)驗(yàn)組籍瑪貧u叫1韶l公、dy卜O1d7d14d圖9，各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CyPA蛋白表達(dá)的變化(相對值)*與對照組相比尸<0.05討論阿爾茨海默病又稱為早老性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病。在西方發(fā)達(dá)國家，由AD導(dǎo)致的癡呆在老年癡呆病人中約占57%，嚴(yán)重威脅人類健康，我國流行病學(xué)調(diào)查也得到了類似的結(jié)果l9]。AD患者的主要病理特征之一是在大腦皮層和海馬出現(xiàn)大量的老年斑，其主要成分是Ap。1992年Handy等提出的“瀑布假說”(Cascade場pothesis)為Ap毒性學(xué)說奠定了理論基礎(chǔ)
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R749.16;R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 張振馨,ZahnerGE,RomanGC,劉君,洪震,屈秋民,劉協(xié)和,張曉君,周玢,武成斌,唐牟尼,洪霞,李輝;中國北京、西安、上海和成都地區(qū)癡呆亞型患病率的研究[J];中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志;2005年03期

本文編號：2608886