【摘要】： 目的： ①從新生大鼠的脊髓分離培養(yǎng)并鑒定神經(jīng)干細(xì)胞，為神經(jīng)干細(xì)胞的體外和體內(nèi)研究建立一個(gè)技術(shù)平臺(tái)；②探討血管性癡呆大鼠模型的制作，為研究血管性癡呆的發(fā)病機(jī)理和防治建立基礎(chǔ)；③探討神經(jīng)干細(xì)胞在血管性癡呆大鼠海馬中的存活、遷移和分化，從而為神經(jīng)干細(xì)胞的體內(nèi)存活、遷移和分化機(jī)理研究和臨床移植治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： ①利用無血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)從新生大鼠脊髓分離具有單細(xì)胞克隆能力的細(xì)胞群并連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得大量克隆細(xì)胞，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)巢蛋白(Nestin)和分化后特異性成熟神經(jīng)細(xì)胞抗原表達(dá)；②利用永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈法建立癡呆模型，結(jié)扎后飼養(yǎng)30天，以Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)和空問探索試驗(yàn)來檢測(cè)模型的建立結(jié)果，并在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)的變化；③利用腦立體定位技術(shù)將5—溴—2′—脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記后的神經(jīng)干細(xì)胞移植入血管性癡呆大鼠海馬內(nèi)，飼養(yǎng)8周后取腦，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)移植后細(xì)胞的生存、遷移和分化。 結(jié)果： ①從新生大鼠脊髓分離的細(xì)胞群具有連續(xù)克隆能力，表達(dá)Nestin蛋白，分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原；②成年大鼠在結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈30天后，進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，定位航行試驗(yàn)比較，實(shí)驗(yàn)組第1，4～7天平均逃避潛伏期較對(duì)照組長(zhǎng)，兩組有顯著性差別；空間探索試驗(yàn)比較，60秒內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠在平臺(tái)象限的滯留時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組滯留時(shí)間短，大鼠出現(xiàn)明顯的記憶能力下降，光學(xué)顯微鏡下顯示海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)元核固縮；③用BrdU標(biāo)記后的神經(jīng)干細(xì)胞在移植入血管性癡呆大鼠海馬8周后能檢測(cè)到BrdU陽性細(xì)胞的存在并向四周遷移，并且用免疫熒光化學(xué)雙標(biāo)方法檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞在海馬錐體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層為MAP_2陽性細(xì)胞，而海馬其它部位則為GFAP或Gc陽性細(xì)胞。 結(jié)論： ①從新生大鼠脊髓中分離培養(yǎng)出的細(xì)胞具有干細(xì)胞的自我更新、多分化潛能的生物學(xué)特征，是脊髓神經(jīng)干細(xì)胞；②用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈方法能成功制作 血管性癡呆大鼠模型:③將標(biāo)記后脊髓神經(jīng)干細(xì)胞移植入血管性癡呆大鼠的海馬 內(nèi)，神經(jīng)干細(xì)胞能生存，并且能夠遷移至四周，在不同微環(huán)境下可分化為神經(jīng)元、 星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，顯示神經(jīng)干細(xì)胞具有強(qiáng)可塑性。
【圖文】：

采用有限稀釋法標(biāo)記僅有]個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔并動(dòng)態(tài)觀察，結(jié)果顯示單個(gè)在培養(yǎng)24h后分裂成2一4個(gè)細(xì)胞的集落，2一4d分裂成20一40個(gè)細(xì)胞的集7一lod均發(fā)展為上百個(gè)細(xì)胞的大克隆，細(xì)胞球形態(tài)同前，分散后能連續(xù)傳分裂過程仍同上，呈懸浮球形生長(zhǎng)。三、Not角抗原的表達(dá)和行rdU標(biāo)記來自新生大鼠脊髓的細(xì)胞集落貼壁2h后用Nestin抗體行免疫熒光染果顯示呈、estin抗原陽性(圖2)。單細(xì)胞克隆后代與此相同。在傳代30的克隆仍顯示為Nestin抗原陽性。在有血清培養(yǎng)7d后行、estin免疫熒光未見任何Nestin抗原陽性細(xì)胞。Brd〔標(biāo)記結(jié)果顯示克隆的大部分細(xì)胞為陽性細(xì)胞，表明克隆主要山分裂增殖的細(xì)胞組成。單克隆化培養(yǎng)的細(xì)胞球用BrdU標(biāo)記后，用抗BrdU抗體行免疫熒光染色3rdL抗原陽性(圖3)。

圖5在多聚賴氨酸包被玻片!幾誘睜分化7d后克隆細(xì)胞早.以少，\l’}樸性日了!’!C免疫熒光)【K4()()討淪!992年神經(jīng)T細(xì)胞概念提出后，研究表明!’飛’“i，海與、紋狀體、響室卜，撇svZ或室竹膜卜帶侶EZ)是神經(jīng)生發(fā)的隊(duì)域，即使到J’成年，仍有神經(jīng)兒發(fā)‘!一，血脊髓則價(jià):成年沒有神經(jīng)瓜的生成，即使是脊髓損傷后，也只是生成鑲痕組織來修艾縱然如此，脊髓，，!，也己發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)干細(xì)胞，并已為)”人研究者所一認(rèn)1司，作為干細(xì)飽，脊髓神經(jīng)干細(xì)胞也應(yīng)具有以卜屬性:;勿能生成神經(jīng)組織或源自神經(jīng)系統(tǒng);②有fl我更新筱力，通過對(duì)稱分裂能生成同己的子代紅川泡:③有多分化潛能，通過不對(duì)稱分裂能生成非己的子代細(xì)胞。作為神經(jīng)一「細(xì)胞，根據(jù)1997年Mcka}’}”l在Science卜發(fā)表的文章認(rèn)為.就是指具有分化為神經(jīng)元細(xì)咆、獄形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我史新井足以提供人最腦組織細(xì)飽的細(xì)胞。祖細(xì)飽足相
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2596757