【摘要】： 隨著人口老齡化的發(fā)展,阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者數(shù)量逐年增多,但目前尚缺乏有效的治療手段,給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques,SP),和細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)是兩個顯著的神經(jīng)病理特征。Aβ由β淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein,APP)經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶裂解生成,早老素(presenilin,PS)包括PS1和PS2,是γ分泌酶的主要活性成分,對Aβ的生成至關(guān)重要。此外,PS蛋白在胚胎發(fā)育、神經(jīng)母細(xì)胞分化、神經(jīng)元凋亡、tau蛋白過度磷酸化和神經(jīng)細(xì)胞黏附中也具有重要作用。 PS cDKO(conditional double knockout,cDKO)小鼠前腦(皮層和海馬)PS基因被特異性敲除,出生3周后,PS1和PS2基因才開始特異性失活,并逐漸出現(xiàn)年齡依賴性的神經(jīng)退行性病變和腦組織病理學(xué)異常,如突觸丟失、神經(jīng)元死亡、大腦皮層萎縮、海馬神經(jīng)元分子層和胼胝體萎縮,側(cè)腦室和第三腦室擴(kuò)大,tau蛋白過度磷酸化。2個月即出現(xiàn)記憶力和突觸可塑性降低,并且隨著年齡的增長逐漸加重。因此PS cDKO小鼠是目前較好的研究PS功能的轉(zhuǎn)基因動物模型,也是較好的AD轉(zhuǎn)基因模型,通過基因操作的方式模擬了AD的神經(jīng)退行性病變和癡呆的癥狀。由于PS1和PS2在前腦特異性失活,Aβ生成減少,未見SP,也沒有Aβ介導(dǎo)的氧化應(yīng)激,因而,PS cDKO小鼠的發(fā)病機(jī)制和主流的“Aβ毒性學(xué)說”不符。有研究表明,PS cDKO小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降并非由于大量的Aβ聚集,而是由于PS功能喪失,炎癥相關(guān)基因表達(dá)增加所致。蛋白質(zhì)是主要功能的執(zhí)行者,其表達(dá)和翻譯后修飾(post translational modification,PTM)對AD的病理過程有至關(guān)重要的影響,目前在PS cDKO小鼠中知之甚少。因此,我們利用二維液相色譜(two-dimensional liquid chromatography,2-DL)分離的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)和其它分子生物學(xué)方法,觀察PS cDKO小鼠與野生型(wild-type,WT)小鼠腦組織的蛋白表達(dá)差異;同時(shí),分析PS cDKO小鼠腦組織的氧化應(yīng)激情況和蛋白質(zhì)的氧化修飾,在蛋白水平上探討PS cDKO小鼠AD樣病理變化的分子機(jī)制。另一方面,與PS cDKO相反,NR2B轉(zhuǎn)基因小鼠是一種學(xué)習(xí)記憶增強(qiáng)的模式動物,關(guān)于NR2B小鼠腦組織的蛋白表達(dá)情況,目前的了解也不多。因此,采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,對這兩種模式動物的腦組織蛋白同時(shí)進(jìn)行研究,更加有利于分析蛋白在AD中的功能。 本論文分為4章。第一章分析了目前常用的幾種蛋白質(zhì)分離方法,重點(diǎn)討論了蛋白樣品的純化方法,以及我們所采用的二維液相色譜分離系統(tǒng)PF2D方法的穩(wěn)定性、可靠性,為后面的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。第二章分別分離并鑒定了不同月齡的PS cDKO小鼠與WT小鼠、NR2B小鼠與WT小鼠腦組織的蛋白質(zhì)差異表達(dá),并對部分差異蛋白采用Western blot進(jìn)行了確認(rèn),同時(shí),分析了這些差異蛋白與神經(jīng)退行性疾病(包括AD)的關(guān)系。第三章研究了不同月齡的PS cDKO小鼠腦組織和肝組織的氧化產(chǎn)物和抗氧化物水平,并對其氧化應(yīng)激情況進(jìn)行了分析。第四章綜述了目前人們對PS、NR2B和AD的研究,AD的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,以及AD與氧化應(yīng)激等方面的認(rèn)識。具體如下: 首先,對PF2D中的蛋白樣品處理方法和系統(tǒng)的重復(fù)性進(jìn)行摸索。由于腦組織中含有較多的脂質(zhì)和脂蛋白等雜質(zhì),對于等電聚焦色譜的分離效果有一定的影響,因此我們對不同的蛋白除脂方法進(jìn)行了比較,如超速離心、丙酮沉淀、異丙醇/正己烷、Freon和Cleanasite法。最終我們選擇了蛋白損失少、易操作且重復(fù)性高的Freon和Cleanasite法除脂。重復(fù)上樣后分離結(jié)果顯示,系統(tǒng)一維和二維的重復(fù)性都較好。峰面積和蛋白濃度成正比,從而保證了用于蛋白差異表達(dá)分析時(shí)的可靠性。 其次,我們利用上述實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),分別分離鑒定了不同月齡的PS cDKO、NR2B小鼠腦組織的蛋白表達(dá)譜。PS cDKO的結(jié)果顯示,與WT小鼠相比,2月齡顯著差異的峰有26個(6個下調(diào),20個上調(diào)),4月齡有51個(33個下調(diào),18個上調(diào)),6月齡有108個(44個下調(diào),64個上調(diào))。對6月齡小鼠部分差異表達(dá)的峰進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorotion/ionizationtime-of-flight,MALDI-TOF)鑒定,有二氫嘧啶相關(guān)蛋白2(dihydropyrimidinase-like2,DRP-2)、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、微管蛋白、星型膠質(zhì)細(xì)胞絲狀酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、肌酸激酶BB和液泡H~+-ATP酶B2等蛋白,它們與神經(jīng)元生長和可塑性、神經(jīng)元損傷以及ATP合成等功能密切相關(guān)。用Western blot方法檢測其中的GFAP表達(dá)水平,結(jié)果顯示6月齡PS cDKO小鼠海馬與WT相比表達(dá)水平升高,和蛋白組學(xué)結(jié)果趨勢一致。 NR2B的結(jié)果顯示,相對于匹配的WT小鼠,NR2B轉(zhuǎn)基因小鼠有顯著性差異的峰共有了2個,其中有34個上調(diào)、38個下調(diào)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定出的26個蛋白中有14個上調(diào)如谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、網(wǎng)格蛋白輕鏈B(Clathrinlight chain B,Lcb)、NADH2脫氫酶、ATP合成酶等,12個下調(diào)如鳥核苷酸釋放因子1、Pin2/TRF1交互作用蛋白等,它們和神經(jīng)遞質(zhì)、突觸可塑性、神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞循環(huán)、能量代謝、基因轉(zhuǎn)錄等生理功能相關(guān)。Western blot方法檢測結(jié)果表明,GS和Lcb蛋白在NR2B轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)均升高,與蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)果的趨勢一致,進(jìn)一步證實(shí)了二維液相色譜分離、MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定方法的可靠。 對鑒定出的蛋白進(jìn)行功能分析,發(fā)現(xiàn)PS cDKO小鼠和NR2B轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中鑒定出的蛋白,有許多和能量代謝密切相關(guān),表明能量代謝對神經(jīng)元的功能非常重要。ATP合成和神經(jīng)元的可塑性與學(xué)習(xí)記憶能力有密切關(guān)系。這為進(jìn)一步探究PS cDKO轉(zhuǎn)基因小鼠的病理機(jī)制、學(xué)習(xí)記憶能力下降的分子機(jī)制,尋找治療AD可能的藥物靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。 第三,之前有關(guān)氧化應(yīng)激在AD中的作用的實(shí)驗(yàn)都是建立在Aβ生成增加的基礎(chǔ)上,而PS cDKO小鼠腦內(nèi)Aβ生成是減少的。本論文中我們通過檢測氧化產(chǎn)物包括丙二醛(malondialdehyde,MDA)、羧基化蛋白(carbonylated protein)、iPF_(2α)-Ⅵ(F_2-isoprostanes-Ⅵ)和抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(Glutathione peroxidase,GSH-px)水平分析PS cDKO小鼠不同年齡階段的大腦皮層和肝組織的氧化應(yīng)激情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PS cDKO小鼠大腦皮層MDA水平與對照組相比,2、4、7月齡都維持在較高水平,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;蛋白被氧化后產(chǎn)生的羧基化蛋白的含量與對照組相比也明顯升高,在2、4和7月齡組分別升高51%、61%和41%。應(yīng)用Oxyblot免疫標(biāo)記羧基蛋白也進(jìn)一步證實(shí)了這個趨勢。PS cDKO小鼠大腦皮層的抗氧化能力也相應(yīng)有所改變:CAT活性在4月齡和7月齡時(shí)明顯下降;SOD在2、4和7月齡均有升高,其中2月齡和7月齡組和對照組相比,分別升高了12%和45%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組PS cDKO小鼠皮層GSH-px活性與對照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但2月齡雄性小鼠皮層GSH-px活性與同月齡同性別的對照組相比,則明顯升高。GFAP表達(dá)也呈年齡相關(guān)性的增加,在2個月時(shí)表達(dá)就有所升高,與MDA和蛋白氧化水平相一致,進(jìn)一步證實(shí)了PS cDKO小鼠的氧化應(yīng)激過程和免疫炎癥等病理過程密切相關(guān)。 我們還利用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)檢測小鼠大腦皮層脂質(zhì)過氧化物isoprostanes的活性異構(gòu)體之一iPF_(2α)-Ⅵ。結(jié)果表明,PS cDKO小鼠大腦皮層的iPF_(2α)-Ⅵ含量隨著年齡增長迅速增高,在4和7月齡時(shí)和WT相比有顯著性差異;血漿中的iPF_(2×)-Ⅵ在7月齡時(shí)顯著增高,但雌性PScDKO小鼠在4和7月齡都有顯著性差異。 最后,我們對蛋白的氧化修飾進(jìn)行了初步探討。利用肼化生物胞素標(biāo)記氧化修飾的羧基化蛋白,再用鏈霉親和素純化后,酶解、LCQ-MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酮戊二酸脫氫酶、肌動蛋白α亞型、血紅蛋白β1亞單位和絲/蘇氨酸蛋白激酶BUB1在PS cDKO小鼠大腦皮層中發(fā)生氧化修飾。 綜上所述,我們利用二維液相色譜分離和質(zhì)譜的方法驗(yàn)證了PS cDKO小鼠和NR2B轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中多類蛋白水平發(fā)生改變。對這些蛋白的功能進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)尤其與能量代謝和神經(jīng)可塑性功能密切相關(guān);大腦皮層的氧化應(yīng)激在病理過程的早期階段已經(jīng)開始出現(xiàn),是對PS喪失功能的一個早期反應(yīng),這一反應(yīng)和腦Aβ沉積無關(guān);同時(shí)鑒定出部分氧化修飾的蛋白;在PS cDKO AD樣模型小鼠中,氧化應(yīng)激和神經(jīng)元損傷之間的因果關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。
【圖文】：

TM)之間有一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)域 (loopdomain)，，C末端指向胞漿區(qū)。TM6和TM7在胞膜內(nèi)形成一個含水的腔(cavity)，使得位于TM6中的天冬氨酸殘基D257和TM7中的D385靠得非常近(圖4一1中黑色星號所示)，這兩個天冬氨酸殘基對于維持PS的功能具有決定性的作用〔144一146]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TMg的結(jié)構(gòu)非常靈活，可能具有將底物轉(zhuǎn)移到催化部位，以及結(jié)合Y分泌酶抑制劑等功能;TMg中的脯氨酸一丙氨酸一亮氨酸保守序列離催化中心的D257非常近，對于構(gòu)象變化引起催化中心活化非常關(guān)鍵[147]。p如沖口圖4一}嘛黯黯贏蒸嘉巍熬暮en一2‘4種蛋白組成的復(fù)合物，PS構(gòu)成活性中心。PS具有9次垮膜結(jié)構(gòu)，分別位于第6、7垮膜結(jié)構(gòu)域中D257和D385(黑色星號所示)對于維持Y分泌酶的催化功能非常重要。(本圖引自[1411) LZPS的功能PS的功能包括Y分泌酶依賴的功能和丫分泌酶非依賴的功能兩方面(見圖4一2[148])。 L2.1PS的丫分泌酶功能Psl與nicastrin、Aph一1和Pen一2一起組成Y分泌酶復(fù)合物，PS是其催化中心。 1.2

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本文編號：2592135