【摘要】：阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種最常見的老年癡呆癥,患者常常為中老年人,尤其是絕經(jīng)期的婦女。隨著現(xiàn)代社會人口結(jié)構(gòu)老齡化的發(fā)展,已成為繼心臟病、癌癥、卒中之后第四類致死原因。目前臨床上用于抗AD的藥物有很多種,如谷氨酸受體拮抗劑、β淀粉樣蛋白靶向藥物和雌激素替代療法等。但現(xiàn)存藥物都是以預(yù)防和減緩病情發(fā)展為主,且有很多不良之處,如引起毒副作用。最新研究發(fā)現(xiàn),AD主要發(fā)病人群為絕經(jīng)后的婦女,由于絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素發(fā)生了變化而產(chǎn)生影響,體內(nèi)分泌的雌激素通過和受體結(jié)合產(chǎn)生作用,具有提高記憶力,改善認(rèn)知能力的功能。但是,雌激素補(bǔ)充療法最大的弊端就是用藥時間長,對子宮內(nèi)膜壁有刺激作用,可能導(dǎo)致乳腺癌。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(Selective estrogen receptor modulators,SERMs)與雌激素作用相似,通過與不同組織的雌激素受體(Estrogen receptor,ER)結(jié)合而表現(xiàn)出不同的作用,使其在激動中樞神經(jīng)系統(tǒng)時并不會激動其他受體,從而減少雌激素的毒副作用。因此,SERMs成為雌激素的替代藥物。基于以上理論,本課題選用SERMs作用于體外建立的神經(jīng)保護(hù)模型,檢測藥物的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)選用的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12,將其誘導(dǎo)分化成為所需的神經(jīng)細(xì)胞,然后建立Aβ1-42損傷模型,檢測SERMs的代表藥物他莫昔芬(TAM)的神經(jīng)保護(hù)作用。本課題主要包括以下內(nèi)容:1、選用PC12細(xì)胞將其誘導(dǎo)成為神經(jīng)細(xì)胞。加入誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)。采用的實(shí)驗(yàn)方法是:細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法、Real-time PCR、Western blot免疫印跡法。通過檢測神經(jīng)標(biāo)志物的基因水平和蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)標(biāo)志物UCH-L1、神經(jīng)絲蛋白(NFP)和微管相關(guān)蛋白2(MAP2)的基因水平均呈現(xiàn)1.2-2倍的增加。微管相關(guān)蛋白2的表達(dá)量在各個濃度的NGF處理組中隨著NGF劑量的增加而變化,且NGF最佳誘導(dǎo)分化的濃度選為50μg/L。2、建立Aβ1-42神經(jīng)細(xì)胞損傷模型。將誘導(dǎo)后的細(xì)胞給予Aβ1-42處理,造成阿爾茲海默癥體外神經(jīng)細(xì)胞模型,運(yùn)用CCK8法檢測細(xì)胞存活率和活力,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡前和凋亡后的生理變化,JC-1熒光法檢測細(xì)胞線粒體膜勢能的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,向神經(jīng)細(xì)胞加入Aβ1-42進(jìn)行損傷,細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞凋亡顯著增加、細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降,且篩選出Aβ1-42最適損傷濃度為20μmol/L。3、選用選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)的代表藥物他莫昔芬(TAM)研究其對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。通過處理Aβ1-42損傷的細(xì)胞,采用CCK8法檢測細(xì)胞活力,Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)變化,JC-1熒光法檢測細(xì)胞線粒體膜勢能變化,以及采用Western blot免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2蛋白量的表達(dá)改變。本階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:雌激素類藥物及TAM對Aβ1-42引起的神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)細(xì)胞作用。經(jīng)過JC-1熒光檢測法得出結(jié)論,TAM可以一定程度地阻止細(xì)胞線粒體膜勢能下降,對細(xì)胞線粒體具有一定的保護(hù)作用。結(jié)論:本課題已完成PC12細(xì)胞誘導(dǎo)分化和Aβ?lián)p傷模型的建立工作,并驗(yàn)證了SERMs類藥物TAM具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。
【圖文】：

2450μg/L NGF 組 70μg/L NGF 組圖 2.1 不同濃度（μg/L）NGF 處理 PC12 細(xì)胞后的細(xì)胞形態(tài)2.3.2 NGF 對 PC12 細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志物基因水平的影響對加入 NGF 培養(yǎng)的 PC12 細(xì)胞的泛素羧基末端水解酶-1、神經(jīng)絲蛋白 NFP和微管相關(guān)蛋白 2 MAP2 進(jìn)行 RNA熒光定量 PCR分析結(jié)果表明，PC12細(xì)胞分別用 10μg/L、30μg/L、50μg/L 和 70μg/L NGF 處理 72h 后，這三種神經(jīng)元標(biāo)志物 UCH-L1、NFP、MAP2 的基因均有明顯上升的趨勢。而且 50μg/L NGF 處理組相比于 10μg/L、30μg/L 和 70μg/L NGF 處理組的 NFP、UCH-L1 和 MAP2 的基因變化更為明顯，增加倍數(shù)更大(圖 2.2，，圖 2.3，圖 2.4)。

不同濃度（μg/L）NGF處理細(xì)胞后UCH-L1基因水平的變化
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2587172