【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是最為常見的引起老年癡呆的腦部神經(jīng)退行性疾病。但迄今為止，病因和發(fā)病機制仍不明確，提出了許多假說。其中β淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)級聯(lián)假說占主導(dǎo)地位，認為Aβ凝集和聚積是AD病理發(fā)生、發(fā)展的始動因素和中心環(huán)節(jié)，可能是各種因素導(dǎo)致AD的共同途徑。因此圍繞Aβ展開對AD發(fā)生、發(fā)展進程中的各種影響因素及其調(diào)節(jié)的機制探討是目前研究的熱點。 鉛是環(huán)境中普遍存在的具有神經(jīng)毒性的重金屬。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段對鉛尤為敏感。人群流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)慢性職業(yè)鉛暴露和其他金屬接觸與阿爾茨海默癥、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥和精神分裂癥等有關(guān)。同時，動物實驗研究顯示發(fā)育早期鉛暴露是腦內(nèi)的淀粉樣變的危險因素�？梢娿U可能通過影響Aβ的代謝而導(dǎo)致AD樣病變。 因此研究運用生命早期鉛暴露小鼠模型，探討早期鉛暴露引起的遲發(fā)神經(jīng)毒性效應(yīng)及鉛在AD樣變發(fā)生進程中的作用，從而為AD的病因及發(fā)病機制研究提供科學(xué)依據(jù)。 目的 1建立生命早期鉛暴露動物模型，應(yīng)用水迷宮實驗，觀察增齡過程中小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，從而為判定早期鉛暴露對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供依據(jù)。 2分析生命早期鉛暴露對不同月齡小鼠海馬組織β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)基因、β-內(nèi)分泌酶1(β-secreatase-1,BACE1)、早老素-1(Presenilin-1,PS1)的mRNA水平和蛋白表達水平的影響及海馬組織中Aβ的含量的變化，探討鉛暴露對淀粉樣蛋白生成的影響。 3評估鉛暴露對不同月齡小鼠海馬組織整體DNA甲基化水平及APP、PS1基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)的影響，分析鉛暴露導(dǎo)致AD樣病變可能的分子機制，為鉛暴露神經(jīng)毒性分子機制和AD的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。 材料與方法 1研究對象 清潔級成年C57BL/6小鼠90只(雌60只，雄30只)，按雌:雄=2:1合籠飼養(yǎng)，以獲得孕鼠。孕鼠單籠飼養(yǎng)，待其分娩后取雄性仔鼠作為研究對象。仔鼠隨機分為4組，每組80只，分別是生長發(fā)育期鉛暴露組(DP組)：孕鼠飲0.2%醋酸鉛水染毒后經(jīng)母乳給仔鼠染毒直至斷乳（21d）。成年期鉛暴露組(AP組)：仔鼠第6月齡開始飲0.2%醋酸鉛水3個月。生長期和成年期共同暴露組(DAP組)：孕鼠飲0.2%醋酸鉛水染毒后經(jīng)母乳給仔鼠染毒直至斷乳（21d）后，再至其第6月齡開始飲0.2%醋酸鉛水3個月。對照組(C組)：給予無鉛去離子水。 2方法 2.1采用石墨爐原子吸收光譜法測定小鼠血液、海馬組織鉛的含量。 2.2采用Morris水迷宮實驗測定1月齡、6月齡、12月齡、18月齡小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。 2.4采用Real-time PCR、Western blot技術(shù)分別檢測1月齡、6月齡、12月齡、18月齡小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1的mRNA水平和蛋白表達水平。 2.3采用Elisa法檢測1月齡、6月齡、12月齡、18月齡小鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42的含量。 2.5采用高效液相法檢測鉛暴露小鼠海馬組織中基因組DNA甲基化水平。 2.6采用MS-PCR技術(shù)檢測小鼠海馬組織APP基因、PS1基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)。 3統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析；數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差表示，Morris水迷宮中的逃避潛伏期用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，其余變量用單因素方差分析，當多組樣本均數(shù)間總體方差分析有差異時，組間兩兩比較用LSD法分析組間差異。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，檢驗水準為a=0.05。 結(jié)果 1生命早期鉛暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響 1.1血鉛和海馬鉛含量測定結(jié)果顯示，1月齡和6月齡時，DP組和DAP組血鉛和海馬鉛水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)；12月齡和18月齡時，AP組和DAP組染毒結(jié)束，血鉛和海馬鉛水平增高，DP組、AP組和DAP組與C組相比，，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。 1.2水迷宮實驗結(jié)果顯示，1月齡和6月齡時，DP組和DAP組小鼠第三天至第五天的逃避潛伏期均較C組和AP組長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。12月齡和18月齡時，AP組和DAP組染毒結(jié)束，與C組比，鉛暴露各組小鼠第三天至第五天的逃避潛伏期差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P 0.05)，DAP組逃避潛伏期最長；鉛暴露各組跨越平臺次數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。 2生命早期鉛暴露對淀粉樣蛋白生成的影響 2.1Real-time PCR結(jié)果顯示APP、BACE1和PS1mRNA表達量在1、6月齡時DP組和DAP組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)；在12月齡和18月齡時，DP組、AP組和DAP組均高于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.01)。隨著年齡增長， APP、BACE1和PS1mRNA在DP組、AP組和DAP組的表達量均逐漸升高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。 2.2Western blot結(jié)果顯示，APP蛋白、BACE1蛋白和PS1蛋白表達量在12和18月齡時DP組AP組和DAP組均高于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。不同暴露組間APP蛋白、BACE1蛋白兩兩比較顯示，DP組與AP組，DP組與DAP組，AP組與DAP組表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。PS1蛋白在鉛暴露組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。隨著年齡增長，DP組、AP組和DAP組的APP、BACE1、PS1蛋白表達量逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。 2.3不同組小鼠海馬組織Aβ1-40、Aβ1-42的含量結(jié)果顯示，1月齡和6月齡時， Aβ1-40、Aβ1-42的含量在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)；在12月齡和18月齡時，DP組、AP組和DAP組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)，且隨著年齡的增長而呈上升趨勢。 3生命早期鉛暴露對小鼠海馬組織基因組DNA甲基化水平的影響 3.1基因組DNA的甲基化水平比較結(jié)果顯示，不同組小鼠海馬組織基因組DNA的甲基化水平隨著年齡的增長而逐漸降低；1月齡和6月齡時，DP組、DAP組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)；12月齡時，DP組、AP組和DAP組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)，DNA的甲基化水平分別降低1.2%、1.4%、2.0%；18月齡時，DP組、AP組和DAP組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)，DNA的甲基化水平分別降低2.0%、1.5%、2.3%。呈低甲基化狀態(tài)。不同月齡小鼠海馬組織APP基因啟動子甲基化水平在各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。鉛暴露組組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.01)。不同月齡小鼠海馬組織PS1基因啟動子甲基化水平在各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)；不同鉛暴露組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。 結(jié)論 1生命早期鉛暴露可使小鼠血鉛和海馬鉛含量升高，后期排出較慢。 2生命早期鉛暴露能夠損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，即便是在去除了鉛暴露這個危險因素后也將持續(xù)存在學(xué)習(xí)記憶能力的損害。 3生命早期鉛暴露可造成小鼠大腦海馬組織中APP過度表達，同時海馬組織中BACE1、PS1的表達增高，而導(dǎo)致Aβ生成增多。 4鉛暴露可降低小鼠海馬組織基因組DNA的甲基化水平；APP基因、PS1基因啟動子區(qū)呈低甲基化狀態(tài)。
【圖文】：

C 組 DP 組 AP 組 DAP 組圖 2.3 12 月齡小鼠尋找平臺的軌跡圖2.5.3.1 定位航行實驗結(jié)果本研究中 1 月齡、6 月齡、12 月齡和 18 月齡小鼠來自 4 個組，但在不同月齡隨機選擇 10 只進行試驗，而不是同一批小鼠，故試驗數(shù)據(jù)分析只考慮 1 月齡、6 月齡、12 月齡、18 月齡小鼠的分組因素和不同訓(xùn)練天數(shù)的變化情況。從表 2.3～2.6，用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析定位航行試驗結(jié)果，各時間點之間的關(guān)系是否滿足 Huynh-Feldt 條件進行球形檢驗，結(jié)果為 P＞0.05，說明重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間不存在相關(guān)性，滿足 Huynh-Feldt 條件，可用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的單變量方差分析處理資料，1 月齡時分組因素分析，各組 5d 內(nèi)的逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.782，P=0.001)，相同時間點組間兩兩比較顯示從第三天開始直至第五天，鉛暴露組小鼠逃避潛伏期高于 C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。6 月齡時各組 5d 內(nèi)的逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=17.982，P=0.002)，同一月齡小鼠，組間兩兩比較結(jié)果顯示從第 3 天開始直至第 5 天，鉛暴露組小鼠逃避潛伏期高于 C 組，

注：經(jīng)ANOVA，與同一月齡對照組比較，*P<0.05，鉛暴露組內(nèi)，與DP 組比圖 2.4 不同組各月齡小鼠穿越平臺位置的次數(shù)變化趨勢2.5.4 體內(nèi)鉛含量和學(xué)習(xí)記憶能力之間的關(guān)系由表 2.8 可見各月齡小鼠水迷宮逃避潛伏期與血鉛和海馬鉛呈正越平臺位置的次數(shù)呈負相關(guān)。表 2.7 小鼠血鉛和海馬鉛與空間學(xué)習(xí)記憶能力指標之間的相關(guān)性分血鉛含量 海馬組織鉛r P r 逃避潛伏期 0.603 0.001 0.715 1 月齡穿越平臺次數(shù) -0.654 0.011 -0.654 逃避潛伏期 0.675 0.012 0.723 6 月齡穿越平臺次數(shù) -0.503 0.018 -0.772 逃避潛伏期 0.660 0.001 0.675
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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2 戚其平,楊艷偉,姚孝元,丁亮,王雯,劉韻源,陳元,楊志平,孫玉東,袁寶珊,于傳龍,韓良峰,劉學(xué),胡小紅,劉亞平,杜正東,曲莉萍,孫芳;中國城市兒童血鉛水平調(diào)查[J];中華流行病學(xué)雜志;2002年03期

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本文編號：2560109