【摘要】：吸毒是目前世界范圍內(nèi)重大的社會(huì)問(wèn)題,毒品成癮(drug addiction)影響著人類的健康、社會(huì)的穩(wěn)定。全世界每年約20萬(wàn)人死于吸毒,我國(guó)登記在冊(cè)的吸毒人數(shù)有100萬(wàn)左右,但實(shí)際人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這個(gè)數(shù)。毒品成癮已經(jīng)成為了我國(guó)日益嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。毒品成癮是指不擇手段、不記后果地強(qiáng)制性地獲取、使用某種毒品。對(duì)毒品的依賴性一旦形成,即可能伴隨終生,它具有極高的復(fù)發(fā)性,甚至在戒斷多年后仍有可能復(fù)發(fā),對(duì)社會(huì)造成很嚴(yán)重的危害。開(kāi)展毒品成癮機(jī)制的研究,并進(jìn)一步尋找有效的治療成癮的藥物,具有深遠(yuǎn)的社會(huì)意義,刻不容緩。毒品成癮性的形成是一個(gè)綜合性的過(guò)程,受多種因素調(diào)控,既受心理性、社會(huì)性因素影響,也受基因遺傳性因素影響。而毒品依賴性的形成是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程,在此過(guò)程,機(jī)體在分子、細(xì)胞學(xué)水平發(fā)生了代償性變化,包括基因表達(dá)的變化和神經(jīng)元形態(tài)的變化,這些代償性的變化改變單個(gè)神經(jīng)元的功能,進(jìn)而影響神經(jīng)通路的功能并最終導(dǎo)致行為學(xué)上的一系列改變。近年的研究發(fā)現(xiàn),Rho家族信號(hào)通路在藥物成癮過(guò)程中起著重要的作用。Rho家族包括Rho,Rac1和Cdc42,屬于Ras家族小GTPases家族成員,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),Rho家族在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生與細(xì)胞遷移中起重要調(diào)控作用cdc42在調(diào)控細(xì)胞骨架、細(xì)胞增殖,基因轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞遷移中起著重要的作用。Cdc42分別以活化的GTP-Cdc42和無(wú)活性的GDP-Cdc42形式存在。活化的GTP-Cdc42與其下游的效應(yīng)分子結(jié)合,從而導(dǎo)致一系列的生物學(xué)事件。Cdc42與Rho-鳥苷三磷酸交換因子(Rho-GEFs)間有著重要的聯(lián)系。細(xì)胞外信號(hào)分子通過(guò)激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而調(diào)節(jié)樹(shù)突樹(shù)與樹(shù)突棘的生長(zhǎng)、分支與重構(gòu),進(jìn)而影響神經(jīng)元的功能。近年來(lái),眾多研究證實(shí)Rho家族在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生與神經(jīng)元遷移中(migration)起重要調(diào)控作用。Rho家族在神經(jīng)元樹(shù)突結(jié)構(gòu)與可塑性的形成中起重要的作用。應(yīng)用Rho家族活性突變體(constitutively active mutant)與負(fù)顯性突變體(dominant negative mutant)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cdc42參與神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)、分支與分支穩(wěn)定性等多項(xiàng)生物學(xué)事件的調(diào)節(jié)。業(yè)已證明,樹(shù)突樹(shù)與樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)的修飾和重構(gòu)參與學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)的神經(jīng)元可塑性(plasticity)的形成。Cdc42在神經(jīng)元樹(shù)突結(jié)構(gòu)可塑性形成中起著重要的作用,但是cdc42是否參與可卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)元樹(shù)突重塑尚不清楚。我們利用Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建了cdc42前腦特異性基因敲除小鼠(cdc42基因全身性敲除為胚胎致死性),而且我們這個(gè)基因的敲除為漸進(jìn)性敲除,CamKII-Cre啟動(dòng)子在小鼠出生后三周開(kāi)始表達(dá),敲除區(qū)域從海馬CA1區(qū)開(kāi)始,到整個(gè)海馬,到紋狀體,隨著年齡的增長(zhǎng),敲除區(qū)域不斷擴(kuò)大。我們利用3月齡和6月齡的cdc42前腦特異性基因敲除小鼠進(jìn)行一系列行為學(xué)實(shí)驗(yàn),首先觀察cdc42的敲除是否影響小鼠的基礎(chǔ)行為學(xué),這些基礎(chǔ)的生理機(jī)能包括焦慮與抑郁的表現(xiàn)、自主活動(dòng)能力、學(xué)習(xí)記憶能力。進(jìn)一步,制備可卡因成癮模型,利用條件位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)與行為敏化實(shí)驗(yàn)揭示cdc42是否參與了小鼠可卡因成癮行為學(xué)的形成。首先進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)鑒定出我們需要的基因敲除小鼠,然后針對(duì)cdc42前腦特異性基因敲除小鼠進(jìn)行了系列基礎(chǔ)行為學(xué)檢測(cè),同時(shí)也對(duì)同齡的WT(wild type)小鼠進(jìn)行相同的檢測(cè),包括高架迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated-plus maze)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test)、懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspended test)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open-field test)、自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)(spontaneous test)、水迷宮實(shí)驗(yàn)(morris water maze)。進(jìn)一步,進(jìn)行了可卡因成癮行為學(xué)實(shí)驗(yàn),包括條件位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)(Conditioned placepreference)、行為敏化實(shí)驗(yàn)(behavior sensitization).本研究的主要結(jié)果如下：1、利用PCR進(jìn)行基因表型鑒定：cre的特異性條帶為600 bp, loxp的條帶大小為700bp,小鼠被鑒定出同時(shí)具備這兩條條帶,為我們需要的基因敲除小鼠。2、Cdc42前腦特異性敲除對(duì)小鼠基礎(chǔ)學(xué)習(xí)記憶能力的影響：在水迷宮實(shí)驗(yàn)(morris water maze)中,在訓(xùn)練過(guò)程中兩組逃避潛伏期的變化(escape latency),3月齡KO小鼠較3月齡WT小鼠相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；6月齡KO小鼠與6月齡WT小鼠相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);經(jīng)過(guò)相同時(shí)間的訓(xùn)練后,3月與6月齡的KO小鼠在測(cè)試天的指標(biāo)：目標(biāo)象限的路程的百分比、時(shí)間的百分比、穿越平臺(tái)的次數(shù)與相應(yīng)的WT組相比,都比WT組少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。游泳的平均速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、Cdc42前腦特異性敲除對(duì)小鼠基礎(chǔ)焦慮行為的影響：在高架迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated-plus maze)中,3月與6月齡的KO小鼠,它們?cè)谝?guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)以及開(kāi)臂滯留時(shí)間與相應(yīng)的WT小鼠相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4、Cdc42前腦特異性敲除對(duì)小鼠基礎(chǔ)抑郁行為的影響：在迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test)、懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspended test)中,3月與6月齡的KO小鼠,它們?cè)谝?guī)定時(shí)間內(nèi)的絕對(duì)不動(dòng)時(shí)間與相應(yīng)的WT小鼠相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5、Cdc42前腦特異性敲除對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響：在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open-field test),3月與6月齡的KO小鼠,它們規(guī)定時(shí)間內(nèi)的總路程與相應(yīng)的WT小鼠相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,運(yùn)動(dòng)速度兩組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6、Cdc42參與了可卡因成癮小鼠條件位置偏愛(ài)的形成：在條件位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)中,分3個(gè)月齡6個(gè)月齡兩個(gè)年齡段進(jìn)行實(shí)驗(yàn),第一天不給藥,放入中間箱,適應(yīng)環(huán)境,第二天測(cè)試小鼠的天然偏愛(ài)(偏愛(ài)黑箱),后隔天分別給予生理鹽水及可卡因刺激,劑量按20mg/kg給予,給生理鹽水放入黑箱,給可卡因放入白箱,如此訓(xùn)練三次六天,后測(cè)試,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)年齡段的cdc42前腦特異性基因敲除小鼠與相應(yīng)年齡的WT小鼠相比,cdc42基因敲除小鼠的訓(xùn)練前后在白箱停留的時(shí)間差明顯比WT小鼠短,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),說(shuō)明cdc42參與了條件位置偏愛(ài)的形成。7、Cdc42參與了可卡因成癮小鼠行為敏化的形成：在行為敏化實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程中,分3個(gè)月齡6個(gè)月齡兩個(gè)年齡段進(jìn)行實(shí)驗(yàn),首先給予四天的生理鹽水刺激,每天一針,劑量按20mg/kg給予,3月齡的KO小鼠與WT小鼠相比,自主活動(dòng)次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6月齡的KO小鼠與WT小鼠相比,自主活動(dòng)次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。之后連續(xù)七天,每天給予一針可卡因刺激,劑量按20mg/kg給予,給予刺激后立即放入自主活動(dòng)箱中,記錄刺激后1小時(shí)內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù),發(fā)現(xiàn)兩個(gè)年齡段的兩個(gè)組相比,KO小鼠給予可卡因刺激后,自主活動(dòng)次數(shù)明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。在第19天再給予與之前同劑量的可卡因challenging,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)年齡段的兩個(gè)組相比,KO小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)較WT小鼠明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。也說(shuō)明cdc42參與了行為敏化的形成。通過(guò)上述研究,我們得出以下結(jié)論：一、成功的構(gòu)建了cdc42前腦特異性基因敲除小鼠,為下一步的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。二、水迷宮實(shí)驗(yàn)提示cdc42前腦特異性敲除影響了小鼠的基礎(chǔ)空間學(xué)習(xí)記憶能力,基因敲除小鼠的基礎(chǔ)空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。三、在高架迷宮實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),cdc42前腦特異性敲除并未影響小鼠的基礎(chǔ)焦慮行為。四、在懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),cdc42前腦特異性敲除并未影響小鼠的基礎(chǔ)抑郁行為。五、在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中可以看出,cdc42前腦特異性敲除并未影響小鼠的基礎(chǔ)自主活動(dòng)行為。六、cdc42參與了可卡因成癮小鼠條件位置偏愛(ài)的形成,基因敲除小鼠條件位置偏愛(ài)的形成比WT更加緩慢。七、cdc42參與了可卡因成癮小鼠行為敏化的形成,cdc42前腦特異性基因敲除小鼠的活動(dòng)比WT小鼠更加活躍。綜上所述,本研究成功構(gòu)建了cdc42前腦特異性基因敲除小鼠,并利用一系列的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證cdc42前腦特異性敲除對(duì)小鼠的影響,也驗(yàn)證了cdc42在cocaine成癮過(guò)程中的作用。結(jié)果表明,cdc42的前腦特異性敲除對(duì)小鼠的基礎(chǔ)抑郁、焦慮、自主活動(dòng)行為并無(wú)影響,但影響了小鼠的基礎(chǔ)空間學(xué)習(xí)記憶能力,它的敲除明顯的降低了小鼠的空間按學(xué)習(xí)記憶能力。cdc42也參與了小鼠cocaine成癮行為的形成,在行為敏化實(shí)驗(yàn)中,基因敲除小鼠的活動(dòng)比WT小鼠更加活躍,而在條件位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)中,基因敲除小鼠條件位置偏愛(ài)的形成比WT更加緩慢。本研究提示cdc42在cocaine成癮的過(guò)程中起著重要的作用,也為下一步篩選成癮戒斷藥物提供啟示。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R749.64

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本文編號(hào)：2543638