【摘要】：阿爾茨海默病(alzheimer's disease, AD)是一種以進行性記憶障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病,是老年期的常見病和多發(fā)病；目前世界面臨著老齡化,AD發(fā)病率日益增多,因此,對AD的病理生理研究及治療手段的探討已成為國際醫(yī)藥界研究的熱點。 AD是多病因參與的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變的疾病,病因非常復雜,參與因素也非常多。病理上神經(jīng)原丟失、膠質(zhì)細胞增殖及相關(guān)物質(zhì)的異常改變、神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)受體的減少、神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載、細胞外β-淀粉樣蛋白(beta-amyloids protein,Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaque, SP)、細胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的大量神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)、神經(jīng)細胞凋亡以及神經(jīng)炎癥等都與AD發(fā)生密切相關(guān),建立相應的體內(nèi)/外擬AD模型,探討其發(fā)病機制和治療手段是非常必要的。 經(jīng)過長期的研究,已經(jīng)知道,Aβ在腦內(nèi)的沉積是AD發(fā)病的重要機制,腦室投放Aβ肽段可以誘發(fā)動物記憶障礙,如果結(jié)合鋁和重組人類轉(zhuǎn)化生長因子-β1(recombinant human transforming growth factor-β1, RHTGF-β1)建立多因素神經(jīng)損傷擬AD模型,能更全面模擬人類AD病理生理特征,更貼近人類AD多因素致病特點。 半枝蓮黃酮(Scutellaria barbata flavonoids, SBF)是從半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)地上部分分離的黃酮類化合物,以野黃芩苷為主。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),SBF具有解熱、抗菌、抗突變和抗氧化等多種功效,對去勢大鼠記憶障礙和神經(jīng)病理學改變具有明顯的改善作用,但對Aβ25-35聯(lián)合鋁和RHTGF-β1擬AD模型相關(guān)研究未見報道。本研究利用腦室注射Aβ25-35聯(lián)合三氯化鋁(aluminium trichloride, AlC13)和RHTGF-β1建立擬AD模型,通過對該復合Aβ25-35模型大鼠學習記憶能力、神經(jīng)病理學、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及相關(guān)蛋白、線粒體凋亡通路中凋亡因子的檢測,確定SBF改善該復合Aβ25-35所致大鼠記憶障礙和神經(jīng)損傷的作用,以及其對系列分子綜合調(diào)節(jié)的多途徑、多靶點的作用機制。 第一部分半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠記憶障礙和神經(jīng)損傷的改善作用 目的：利用大鼠腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlC13和RHTGF-β1擬AD記憶障礙及神經(jīng)損傷模型,檢測SBF對該復合Aβ25-35所致大鼠記憶障礙及神經(jīng)損傷的改善作用。方法：300-350g雄性SD大鼠,手術(shù)前在二級動物實驗室適應性飼養(yǎng)1w。手術(shù)第1d腦室注射RHTGF-β11μl(10ng),手術(shù)第2d側(cè)腦室注射Aβ25-354μg/d和1%AlCl33μl/d,上午注射Aβ25-35,連續(xù)注射14d；下午注射溶液AlCl3,連續(xù)5d;假手術(shù)對照組大鼠做同樣手術(shù),但腦室注射等體積的生理鹽水。大鼠在手術(shù)后第45d采用Morris大鼠水迷宮進行記憶障礙模型成功篩選,利用每只注射復合Aβ25-35大鼠和假手術(shù)組大鼠第4d水迷宮游泳成績計算模型成功篩選率(screening ratio,SR),當某只大鼠SR大于0.2時,該只大鼠即為記憶障礙模型成功大鼠。在動物手術(shù)第49d,所有記憶障礙模型成功大鼠隨機分4組：模型對照組和SBF三個劑量組。SBF三個劑量組大鼠分別灌胃SBF35、70和140mg/kg38d,模型對照組和假手術(shù)對照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水。在給藥第31d(即手術(shù)第79d),所有大鼠進行Morris水迷宮記憶能力測試,連續(xù)測試7d。水迷宮測試的1、2d進行定位航行實驗,檢測大鼠對空間記憶獲得能力；測試第3d撤去平臺進行空間探索實驗,檢測大鼠記憶保持能力；測試第4、5和6d將平臺放在目標象限對側(cè)進行對側(cè)實驗,檢測大鼠記憶再現(xiàn)能力；測試第7d將平臺露出水面2cm,檢測大鼠的游泳速度。在水迷宮結(jié)束后的第2d,所有大鼠在手術(shù)的第86d,即給藥的第38d斷頭處死,肉眼大體觀察大腦的組織學病理變化：蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)、硫瑾染色觀察神經(jīng)細胞形態(tài)學變化；電子顯微鏡觀察神經(jīng)細胞亞細胞結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：大鼠在4d的水迷宮記憶障礙模型成功篩選中發(fā)現(xiàn),所有大鼠在4d的訓練中找到平臺的潛伏期都隨著訓練天數(shù)的增加逐漸縮短,根據(jù)注射復合Aβ25-35的每只大鼠和假手術(shù)對照組大鼠,在水迷宮訓練第4d找到平臺的潛伏期所計算的SR值大于0.2,本實驗大鼠記憶障礙模型成功率94.7%。在水迷宮定位航行實驗中發(fā)現(xiàn),模型對照組大鼠第1、2d找到平臺的潛伏期比假手術(shù)對照組明顯增加(P0.01)；而SBF35、70和140mg/kg組大鼠與模型對照組相比可顯著縮短大鼠找到平臺的潛伏期(P0.01)。在水迷宮空間探索實驗中發(fā)現(xiàn),模型對照組大鼠60s在目標象限(第一象限)的游泳時間、游泳路程和穿越次數(shù)比假手術(shù)對照組都明顯減少(P0.01)；而SBF三個劑量不同程度地逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致大鼠上述異常改變,使注射復合Aβ25-35的大鼠60s在目標象限的游泳時間、游泳路程和穿越次數(shù)都不同程度地增加(P0.05,P0.01)。在水迷宮記憶再現(xiàn)能力測試中發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)對照組相比,模型對照組大鼠第4、5和6d找到平臺的潛伏期顯著延長(P0.01)；而SBF個三劑量能顯著縮短復合Aβ25-35所致大鼠找到平臺潛伏期的延長(P0.05,P0.01)。水迷宮第7d檢測各組大鼠游泳速度,發(fā)現(xiàn)各組大鼠找到平臺的潛伏期沒有明顯區(qū)別,表明各組大鼠游泳速度接近,從而排除了大鼠由于游泳速度的差異而影響測試結(jié)果。在手術(shù)術(shù)后第86d,各組大鼠斷頭處死,肉眼觀察到模型對照組大鼠腦組織明顯病理學改變,腦質(zhì)量降低,注射側(cè)腦皮質(zhì)表面發(fā)黃,部分鼠皮層塌陷變��；HE和硫瑾染色光鏡檢測發(fā)現(xiàn)海馬、皮層有的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,細胞腫脹,尼氏小體顯著減少,有的出現(xiàn)典型的液化性壞死,壞死區(qū)神經(jīng)元胞膜破裂、核溶解、大量炎性細胞浸潤；電鏡檢測發(fā)現(xiàn),模型對照組大鼠海馬神經(jīng)元固縮、核膜凹陷、核仁邊移、常染色質(zhì)變性凝聚、胞漿內(nèi)核蛋白體解聚、有大量脂褐素、線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,星型膠質(zhì)細胞足突水腫、髓鞘板層破壞、鞘內(nèi)軸索和髓神經(jīng)纖維減退,突觸前膜存在大量的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。然而,SBF35、70和140mg/kg灌胃38d,不同程度地逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致大鼠上述神經(jīng)病理學改變,使神經(jīng)元數(shù)量及尼氏小體增多、未出現(xiàn)神經(jīng)液化性壞死,也明顯減輕海馬神經(jīng)亞細胞結(jié)構(gòu)病理改變。結(jié)論：大鼠腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlC13和RHTGF-p1可以出現(xiàn)記憶障礙和神經(jīng)病理學改變,利用該模型發(fā)現(xiàn)SBF對該復合Aβ25-35所致大鼠記憶障礙和神經(jīng)損傷具有顯著的改善作用。 第二部分半枝蓮黃酮抑制復合Aβ25-35所致大鼠腦內(nèi)Aβ和NFT的異常生成 目的：利用復合Aβ25-35成功模型大鼠,確定復合Aβ25-35可以引起大鼠腦內(nèi)Aβ和NFT異常生成。并通過SBF對腦內(nèi)Aβ和NFT及相關(guān)分泌酶α-、β-和γ-的檢測,闡明SBF通過抑制腦內(nèi)Ap和NFT異常生成而發(fā)揮改善記憶障礙和神經(jīng)損傷的作用機制。方法：所有大鼠末次給藥60min斷頭處死,分離大腦。剛果紅和硝酸銀染色分別檢測腦內(nèi)Ap和NFT；實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)檢測皮層α-、β-和γ-分泌酶mRNA的表達。結(jié)果：與假手術(shù)對照組相比,模型對照組大鼠Aβ剛果紅染色和硝酸銀染色NFT細胞數(shù)量明顯增多(P0.01)；且皮層中聚集NFT的細胞呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維增粗、紊亂,遍布全部細胞質(zhì)并深入細胞突起,形成染色較深的拖尾狀。SBF35、70和140mg/kg灌胃38d不同程度地抑制復合Aβ25-35所致大鼠腦內(nèi)Ap和NFT異常生成,與Aβ對照組相比,SBF35、70和P140mg/kg組大鼠腦內(nèi)Ap和NFT細胞數(shù)都明顯減少(P0.05,P0.01)。qPCR檢測大鼠皮層α-、β-和γ-分泌酶發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)對照組相比,模型對照組皮層β-分泌酶和γ-分泌酶mRNA表達分別增加(P0.01)和降低(P0.05)。然而,SBF70和140mg/kg明顯逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致大鼠皮層p-分泌酶mRNA表達的增加(P0.01),SBF35和140mg/kg使γ-分泌酶的mRNA表達進一步降低(P0.05,P0.01)。 結(jié)論：大鼠腦室注射復合Aβ25-35可以引起腦內(nèi)Ap和NFT異常生成,增加腦內(nèi)β-分泌表達,降低γ-分泌酶的表達。而SBF能夠抑制腦內(nèi)Ap和NFT異常生成,調(diào)節(jié)β/γ-分泌酶表達,表明,SBF改善復合Aβ25-35所致大鼠記憶障礙及神經(jīng)損傷,部分地是通過抑制腦內(nèi)Aβ和NFT異常生成而完成的。 第三部分半枝蓮黃酮抑制復合Aβ25-35所致大鼠腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖與活化 目的：利用復合Aβ25-35成功模型大鼠,確定復合Aβ25-35可以引起大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細胞異常增殖與活化。并通過膠質(zhì)細胞數(shù)量及其活化相關(guān)蛋白的檢測,確定SBF通過抑制復合Aβ25-35所致大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細胞異常增殖與活化而發(fā)揮改善記憶障礙和神經(jīng)損傷的作用機制。方法：所有大鼠末次給藥60min斷頭處死,分離大腦。碳酸銀染色測定小膠質(zhì)細胞(microglia, MG)的數(shù)量；免疫組化法測定星形膠質(zhì)細胞(astrocyte, AS)數(shù)量、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)和誘導型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)的蛋白表達；qPCR法測定內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) mRNA的表達；免疫印跡(western blotting)法測定膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、白細胞共同抗原(leukocyte common antigen, CD45)、熱休克蛋白70(heat shock protein, HSP70)的蛋白表達;RT-PCR法測定ApoE mRNA的表達;ELISA法測定海馬、皮層和紋狀體中白介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、IL-6、IL-8和IL-10的水平。結(jié)果：與假手術(shù)對照組相比,模型對照組大鼠腦內(nèi)AS和MG數(shù)、GFAP/CD45/HSP70(?)PiNOS的蛋白表達以及ApoE和eNOS mRNA的表達都明顯增加(P0.01)；nNOS蛋白表達明顯降低(P0.01);海馬、皮層和紋狀體中IL-1β和IL-10的水平顯著降低(P0.01),TNF、IL-6和IL-8的水平顯著升高(P0.01)。然而,SBF35、70和140mg/kg不同程度地逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致大鼠腦內(nèi)上述異常改變。結(jié)論：復合Aβ25-35可以引起大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細胞異常增殖、以及其活化相關(guān)蛋白GFAP、CD45、HSP70、ApoE和NOS異常表達,引起腦內(nèi)IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10水平異常變化。SBF可以逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致大鼠上述異常變化。提示,SBF改善復合Aβ25-35所致大鼠記憶障礙和神經(jīng)損傷,可能源于其抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞異常增殖與活化而完成的。 第四部分半枝蓮黃酮正向調(diào)節(jié)復合Aβ25-35所致大鼠腦內(nèi)線粒體凋亡通路異常 目的：利用復合Aβ25-35成功模型大鼠,確定復合Aβ25-35能引起大鼠神經(jīng)細胞線粒體凋亡通路中凋亡因子B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma-2, BCL-2)、BCL-2相關(guān)X蛋白(BCL-2associated X protein, BAX)和半胱天冬蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)異常表達,并通過對上述凋亡因子的檢測,確定SBF通過正向調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞線粒體凋亡通路中凋亡因子,而實現(xiàn)改善復合A β25-35所致大鼠記憶障礙和神經(jīng)損傷的分子機制。方法：所有大鼠末次給藥60min斷頭處死,分離大腦。Western blotting測定大鼠皮層BCL-2和BAX蛋白表達,qPCR法測定Caspase-3mRNA表達。結(jié)果：復合Aβ25-35可以引起大鼠神經(jīng)細胞凋亡因子BCL-2、BAX和Caspase-3異常改變,與假手術(shù)對照組相比,模型對照組大鼠皮層中BCL-2蛋白表達顯著降低(P0.05,P0.01),BAX蛋白表達和Caspase-3mRNA表達明顯增加(P0.05,P0.01)。然而,SBF35、70和140mg/kg不同程度地逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致大鼠神經(jīng)細胞凋亡因了的異常表達,與模型對照組相比,SBF三個劑量組BCL-2蛋白表達明顯增加(P0.05,P0.01)、BAX蛋白表達和Caspase-3mRNA表達都明顯降低(P0.05,P0.01)。結(jié)論：復合A β25-35可以引起大鼠神經(jīng)細胞線粒體凋亡通路中凋亡因子BCL-2、BAX和Caspase-3異常表達,而SBF三個劑量不同程度地逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致大鼠神經(jīng)細胞上述異常改變。提示,SBF改善復合Aβ25-35所致大鼠記憶障礙和神經(jīng)損傷是通過正向調(diào)節(jié)腦內(nèi)線粒體凋亡通路異常。 全文結(jié)論 腦室注射AP25-35聯(lián)合AlC13和RHTGF-β可以使大鼠可以出現(xiàn)記憶障礙和標志性神經(jīng)病理學改變。利用該模型,本研究進一步發(fā)現(xiàn),SBF對該復合Aβ25-35所致大鼠記憶獲得、記憶保持和記憶再現(xiàn)障礙,以及神經(jīng)病理學改變都有顯著的改善作用。其作用機制可能是通過抑制腦內(nèi)Aβ和NFT異常產(chǎn)生、抑制腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖與活化以及正向調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞線粒體凋亡通路而實現(xiàn)的。本研究提示,SBF對系列分子綜合調(diào)節(jié)作用是有效改善記憶障礙、神經(jīng)損傷和抗AD作用的基礎,為此闡明了SBF的抗癡呆、改善記憶障礙和神經(jīng)損傷的作用以及多途徑、多靶點的作用機制。
【圖文】：

Figure 6. The typical swimming-tracking path of rats in probe trial by Morris water maze test..1.2.3半枝蓮黃酮對大鼠游泳速度的影響在大鼠水迷宮測試第7d，將平臺露出水面2cm,測定大鼠游泳速度，，圖7顯示，各組大鼠找到平臺的時間沒有明顯區(qū)別，從而排除了因?qū)嶒瀯游飩�體差異對尋找平臺的影響，使水迷宮操作記憶能力的檢測更加可信。I； fl _ _ 自 Ii" I i 1 I”:LU___LI__Li 一sfai control lodel control scf ssie/ke S6f TOig^kc ser ilOief kcVisibU pktlcai trul13
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號：2539088