【摘要】：研究目的 1.研究血清及腦脊液(CSF)載脂蛋白E(ApoE)濃度測定對細(xì)菌性膿毒血癥和細(xì)菌性腦膜炎的診斷價(jià)值。 2.通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),研究自主設(shè)計(jì)的ApoE模擬肽(ApoE23)的抗菌作用及其機(jī)制,為其作為新型抗菌藥物和免疫調(diào)節(jié)劑的潛在臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法 1.將臨床已明確診斷的細(xì)菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎、細(xì)菌性膿毒癥患兒納入研究,以非感染患兒為對照。除常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指標(biāo)(外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、CSF常規(guī)及生化。CSF及血液細(xì)菌培養(yǎng)鑒定、CSF肺炎鏈球菌抗原檢測和革蘭染色、CSF腸道病毒RNA定量PCR檢測)外,采用透射免疫比濁法測定研究對象的CSF及血清ApoE濃度,采用ROC曲線分析確定診斷界值(CUT-OFF),評價(jià)ApoE濃度測定對兒童侵襲性細(xì)菌感染的診斷價(jià)值。 2.自主設(shè)計(jì)ApoE模擬肽ApoE23序列,采用固相合成法合成,高效液相色譜法(HPLC)純化,質(zhì)譜及電噴霧質(zhì)譜對合成肽純度、氨基酸殘基組成及分子量進(jìn)行測定,圓二色譜技術(shù)結(jié)合K3D3軟件進(jìn)行合成肽二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。通過α螺旋輪法檢測其親水氨基酸殘基及疏水氨基酸殘基分布特點(diǎn)。 3. ApoE23抗菌活性采用體外殺菌試驗(yàn)。 4.采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、及定量PCR法檢測ApoE23對LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞(人單核細(xì)胞株)及人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的TNF-a、IL-6、IL-10表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 5.采用B組鼠傷寒沙門菌膿毒血癥小鼠模型研究ApoE23靜脈注射治療對膿毒血癥小鼠死亡率影響,通過對膿毒血癥小鼠脾臟細(xì)菌負(fù)荷測定、血漿LPS、TNF-a、IL-6測定及對脾臟、肺臟、肝臟及小腸形態(tài)或病理切片分析了解ApoE23抗膿毒血癥機(jī)理。 研究結(jié)果 1、共有185例患兒入組,其中細(xì)菌性腦膜炎患者26例,病毒性腦膜炎患兒32例,細(xì)菌性膿毒血癥36例,對照組91例,年齡范圍為1月～13歲。細(xì)菌性腦膜炎患兒腦脊液ApoE濃度與對照組相比明顯增高,而病毒性腦膜炎、膿毒血癥患兒腦脊液ApoE僅輕微升高。當(dāng)腦脊液ApoE濃度cut-off值為1.7mg/L,其診斷細(xì)菌性腦膜炎的敏感度、特異度、分別為0.85(95%CI,0.71-1)、1(95%CI,0.89-1),診斷價(jià)值高于腦脊液WBC計(jì)數(shù)、腦脊液總蛋白、葡萄糖及氯化物。當(dāng)血清ApoE濃度cut-off值為42.0mg/L,其診斷細(xì)菌性膿毒血癥的敏感度、特異度分別為0.80(95%CI,0.64-0.89)、0.93(95%CI,0.88-0.97),診斷價(jià)值高于外周血CRP及WBC計(jì)數(shù)。 2、自主設(shè)計(jì)的ApoE23二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋比例為21.6%,且為兩親性螺旋,較國外同類肽具有更好的組織細(xì)胞穿透性。 3、ApoE23對革蘭陰性桿菌有明顯抗菌活性,其MIC50值為1～1.25μmol/L,低于國外同類肽(ApoEdp),對泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌仍具有明顯殺菌活性。ApoE23對革蘭陽性葡萄球菌的殺菌活性低于革蘭陰性桿菌,對腸球菌及對白色念珠無抗菌活性。 4. ApoE23具有顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的人PBMC及THP-1細(xì)胞TNF-a、IL-6mRNA及蛋白表達(dá)作用,下調(diào)THP-1IL-10mRNA及蛋白表達(dá)作用、下調(diào)人PBMCIL-10蛋白表達(dá)。 5、106CFU劑量B鼠傷寒沙門菌腹腔注射后24小時(shí)內(nèi),生理鹽水治療組小鼠死亡率為60%,ApoE23治療組死亡率為0。ApoE治療組小鼠體內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷、血漿TNF-a、1L-6、LPS濃度均低于生理鹽水治療組。ApoE23治療組小鼠脾臟、肺臟、肝臟及小腸的炎性改變程度明顯低于生理鹽水治療組。 結(jié)論 1、CSF和血清ApoE濃度測定可作為兒童侵襲性細(xì)菌感染的快速診斷指標(biāo),具有良好的特異性和敏感性。 2、自主設(shè)計(jì)的ApoE23抗菌譜窄,可抗胞內(nèi)寄生菌及泛耐藥菌,MIC50低,抗菌活性和組織穿透性優(yōu)于國外同類肽,具有優(yōu)質(zhì)抗菌藥物特性。 3、ApoE23對LPS誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。 4、ApoE23具有的抗菌及免疫調(diào)節(jié)雙重功能,可顯著降低膿毒血癥小鼠死亡率,是潛在的膿毒血癥治療藥物。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 岳昌武;莫寧萍;劉坤祥;凌鋅;曾霓;;抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)·作用機(jī)理及其應(yīng)用前景[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年05期

2 朱德妹;汪復(fù);胡付品;蔣曉飛;倪語星;孫景勇;徐英春;張小江;胡云健;艾效曼;俞云松;楊青;孫自鏞;陳中舉;賈蓓;黃文祥;卓超;蘇丹虹;魏蓮花;吳玲;張朝霞;季萍;王傳清;王愛敏;張泓;孔菁;徐元宏;沈繼錄;單斌;杜艷;;2010年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J];中國感染與化療雜志;2011年05期

3 王莉;朱麗輝;祝益民;孫波;;2010兒科危重癥國際論壇會(huì)議紀(jì)要[J];臨床兒科雜志;2011年04期

4 王輝;楊桂文;吳敬濤;安利國;;抗菌肽作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J];濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年01期

，

本文編號(hào)：2536731