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載脂蛋白E及其模擬肽對細菌感染性疾病診斷和治療作用及機制研究

發(fā)布時間:2019-09-17 07:49
【摘要】:研究目的 1.研究血清及腦脊液(CSF)載脂蛋白E(ApoE)濃度測定對細菌性膿毒血癥和細菌性腦膜炎的診斷價值。 2.通過體外細胞培養(yǎng)和動物實驗,研究自主設計的ApoE模擬肽(ApoE23)的抗菌作用及其機制,為其作為新型抗菌藥物和免疫調(diào)節(jié)劑的潛在臨床應用提供實驗依據(jù)。 研究方法 1.將臨床已明確診斷的細菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎、細菌性膿毒癥患兒納入研究,以非感染患兒為對照。除常規(guī)實驗室檢驗指標(外周血白細胞計數(shù)、CRP、CSF常規(guī)及生化。CSF及血液細菌培養(yǎng)鑒定、CSF肺炎鏈球菌抗原檢測和革蘭染色、CSF腸道病毒RNA定量PCR檢測)外,采用透射免疫比濁法測定研究對象的CSF及血清ApoE濃度,采用ROC曲線分析確定診斷界值(CUT-OFF),評價ApoE濃度測定對兒童侵襲性細菌感染的診斷價值。 2.自主設計ApoE模擬肽ApoE23序列,采用固相合成法合成,高效液相色譜法(HPLC)純化,質(zhì)譜及電噴霧質(zhì)譜對合成肽純度、氨基酸殘基組成及分子量進行測定,圓二色譜技術結合K3D3軟件進行合成肽二級結構分析。通過α螺旋輪法檢測其親水氨基酸殘基及疏水氨基酸殘基分布特點。 3. ApoE23抗菌活性采用體外殺菌試驗。 4.采用體外細胞培養(yǎng)技術、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、及定量PCR法檢測ApoE23對LPS誘導的THP-1細胞(人單核細胞株)及人外周血單個核細胞(PBMC)的TNF-a、IL-6、IL-10表達的調(diào)節(jié)作用。 5.采用B組鼠傷寒沙門菌膿毒血癥小鼠模型研究ApoE23靜脈注射治療對膿毒血癥小鼠死亡率影響,通過對膿毒血癥小鼠脾臟細菌負荷測定、血漿LPS、TNF-a、IL-6測定及對脾臟、肺臟、肝臟及小腸形態(tài)或病理切片分析了解ApoE23抗膿毒血癥機理。 研究結果 1、共有185例患兒入組,其中細菌性腦膜炎患者26例,病毒性腦膜炎患兒32例,細菌性膿毒血癥36例,對照組91例,年齡范圍為1月~13歲。細菌性腦膜炎患兒腦脊液ApoE濃度與對照組相比明顯增高,而病毒性腦膜炎、膿毒血癥患兒腦脊液ApoE僅輕微升高。當腦脊液ApoE濃度cut-off值為1.7mg/L,其診斷細菌性腦膜炎的敏感度、特異度、分別為0.85(95%CI,0.71-1)、1(95%CI,0.89-1),診斷價值高于腦脊液WBC計數(shù)、腦脊液總蛋白、葡萄糖及氯化物。當血清ApoE濃度cut-off值為42.0mg/L,其診斷細菌性膿毒血癥的敏感度、特異度分別為0.80(95%CI,0.64-0.89)、0.93(95%CI,0.88-0.97),診斷價值高于外周血CRP及WBC計數(shù)。 2、自主設計的ApoE23二級結構α螺旋比例為21.6%,且為兩親性螺旋,較國外同類肽具有更好的組織細胞穿透性。 3、ApoE23對革蘭陰性桿菌有明顯抗菌活性,其MIC50值為1~1.25μmol/L,低于國外同類肽(ApoEdp),對泛耐藥鮑曼不動桿菌仍具有明顯殺菌活性。ApoE23對革蘭陽性葡萄球菌的殺菌活性低于革蘭陰性桿菌,對腸球菌及對白色念珠無抗菌活性。 4. ApoE23具有顯著下調(diào)LPS誘導的人PBMC及THP-1細胞TNF-a、IL-6mRNA及蛋白表達作用,下調(diào)THP-1IL-10mRNA及蛋白表達作用、下調(diào)人PBMCIL-10蛋白表達。 5、106CFU劑量B鼠傷寒沙門菌腹腔注射后24小時內(nèi),生理鹽水治療組小鼠死亡率為60%,ApoE23治療組死亡率為0。ApoE治療組小鼠體內(nèi)細菌負荷、血漿TNF-a、1L-6、LPS濃度均低于生理鹽水治療組。ApoE23治療組小鼠脾臟、肺臟、肝臟及小腸的炎性改變程度明顯低于生理鹽水治療組。 結論 1、CSF和血清ApoE濃度測定可作為兒童侵襲性細菌感染的快速診斷指標,具有良好的特異性和敏感性。 2、自主設計的ApoE23抗菌譜窄,可抗胞內(nèi)寄生菌及泛耐藥菌,MIC50低,抗菌活性和組織穿透性優(yōu)于國外同類肽,具有優(yōu)質(zhì)抗菌藥物特性。 3、ApoE23對LPS誘導的體外培養(yǎng)免疫細胞的應答反應具有調(diào)節(jié)作用。 4、ApoE23具有的抗菌及免疫調(diào)節(jié)雙重功能,可顯著降低膿毒血癥小鼠死亡率,是潛在的膿毒血癥治療藥物。
【學位授予單位】:復旦大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2012
【分類號】:R749.16

【參考文獻】

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本文編號:2536731

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