【摘要】：抑郁癥是一種嚴(yán)重的精神心理疾病,會(huì)給病人及其家庭造成非常大的傷害。全球抑郁癥患者估計(jì)影響了全球20%的人口,世界衛(wèi)生組織估計(jì)到2020年將成為威脅人類健康的第二大疾病�？挂钟舭Y藥物自1950年問世以來取得了非常大的進(jìn)展,但是現(xiàn)有抑郁藥物(包括三環(huán)類抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑、選擇性五羥色胺/去甲上腺素再攝取抑制劑)還是對接近三分之一病人的治療效果不理想,即使有治療效果也需規(guī)律用藥數(shù)周才能產(chǎn)生。因此,人們需要更深入理解抑郁癥的病理生理機(jī)制,找到新的治療方法和策略。已有研究提示中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)區(qū)多巴胺(DA)系統(tǒng)在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起了關(guān)鍵作用,并可能作為新的治療靶點(diǎn)。VTA區(qū)DA能神經(jīng)元具有自發(fā)放電特性,并存在規(guī)律性和簇發(fā)性(burst)放電模式。其中burst高頻放電可以顯著調(diào)節(jié)DA水平并影響動(dòng)物行為,而規(guī)律性低頻放電則無此作用。近年已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)VTA區(qū)DA神經(jīng)元的burst放電能夠直接控制嚙齒類動(dòng)物模型的抑郁樣行為。VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮模式可被眾多膜受體和離子通道影響(如NMDA受體、GABAA受體、鈣激活鉀通道、L-型鈣通道、超極化激活陽離子通道、G蛋白調(diào)控的內(nèi)向整流鉀通道等)。它們都可以調(diào)節(jié)DA能神經(jīng)元的興奮性,但對VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮方式的影響和控制原理目前還不是非常清楚。調(diào)節(jié)VTA區(qū)DA能神經(jīng)元細(xì)胞膜上的鉀通道影響其興奮性是其中一種可能存在的方式。例如有研究就發(fā)現(xiàn)敲除VTA區(qū)TREK1鉀通道可以抑制抑郁樣行為的出現(xiàn);選擇性阻斷TREK1通道也可以產(chǎn)生快速抗抑郁作用;VTA區(qū)DA神經(jīng)元鉀通道表達(dá)的改變與社交挫敗模型小鼠的抑郁行為也有明顯相關(guān)性。Kv7/KCNQ通道是一種電壓門控通道,其開放可以導(dǎo)致細(xì)胞超極化,穩(wěn)定細(xì)胞膜并抑制細(xì)胞興奮性。Kv7通道包括Kv7.1-7.5等五種,其中Kv7.2-7.5主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)。已有研究提示Kv7通道可以作為癲癇、焦慮、疼痛、藥物成癮的疾病藥物作用靶點(diǎn)。另外也有研究發(fā)現(xiàn)Kv7通道在DA能神經(jīng)元上有表達(dá)并能調(diào)節(jié)其興奮性。另外也有研究發(fā)現(xiàn)Kv7.4特異性表達(dá)在VTA區(qū)DA能神經(jīng)元上,但其潛在功能還不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)Kv7.4能夠顯著調(diào)節(jié)VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性,并改善社交挫敗模型小鼠的抑郁樣行為。同時(shí),由于Kv7.4通道在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)部位的特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他Kv7亞基,所以Kv7.4可以作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn),并且其副作用會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他治療靶點(diǎn)。第一部分調(diào)節(jié)Kv7.4通道對VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性的影響目的:觀察Kv7通道開放對在體記錄VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性的影響。方法:建立在體單單位(single unit)電生理記錄小鼠VTA DA能神經(jīng)元放電的方法,確定其電生理學(xué)特性;腹腔注射Kv7開放劑(fasudil和RTG)觀察其對VTA區(qū)DA能神經(jīng)元放電的影響。結(jié)果:在此前的研究中,我們利用膜片鉗全細(xì)胞記錄和細(xì)胞貼附模式記錄野生型小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元的自發(fā)放電,給予fasudil(10mM)可以降低其放電頻率,而在Kv7.4敲除小鼠則沒有作用,說明fasudl可以選擇性激活Kv7.4。但是利用這兩種方法無法記錄DA能神經(jīng)元的在體生理放電模式。而只有在在體單電位記錄時(shí),DA能神經(jīng)元存在規(guī)律型(tonic)和簇發(fā)型(burst)兩種放電模式,而后者是影響DA釋放及行為學(xué)的關(guān)鍵因素。因此,在這部分研究中我們首先建立了在體記錄DA能神經(jīng)元放電的方法。小鼠中腦VTA由腦立體定位儀確定。DA能神經(jīng)元放電通過以下特征被確定:典型三向動(dòng)作電位(AP)并有特征性的負(fù)向偏移;AP持續(xù)時(shí)間≥2 ms;AP從開始到超極化的時(shí)間1.1 ms;放電峰頻率10 Hz,偶爾出現(xiàn)burst放電。其中burst放電的起始及終止定義:連續(xù)兩個(gè)AP間隔≤80 ms作為burst放電開始;兩個(gè)連續(xù)AP間隔≥160 ms作為結(jié)束。當(dāng)一個(gè)DA能神經(jīng)元記錄放電1 min內(nèi)出現(xiàn)burst放電即可被認(rèn)為是burst放電神經(jīng)元。在野生型小鼠,腹腔注射Kv7.4選擇性開放劑fasudil(20 mg/Kg)和Kv7非選擇性開放劑retigabine(RTG)均降低了DA能神經(jīng)元的放電頻率,尤其是降低了burst細(xì)胞的放電頻率和burst放電峰百分比(burst放電峰數(shù)/總放電峰數(shù)×100%)。而在Kv7.4敲除小鼠,fasudil對DA能神經(jīng)元的放電沒有影響,而RTG仍降低DA能神經(jīng)元的放電。結(jié)論:建立了在體記錄VTA區(qū)DA能神經(jīng)元放電的方法,并確定了其電生理特性;調(diào)節(jié)Kv7通道(fasudil和RTG)能夠降低VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性,特別是burst放電,其中fasudilt通過選擇性激活Kv7.4降低DA神經(jīng)元興奮性。第二部分Kv7.4在社交挫敗模型小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性和抑郁樣行為變化中的作用目的:觀察Kv7.4在社交挫敗模型小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性改變中的作用方法:建立社交挫敗小鼠模型并明確其抑郁樣行為的標(biāo)準(zhǔn);利用在體電生理記錄方法觀察模型小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性的改變;利用q PCR和western blot技術(shù)觀察抑郁模型小鼠VTA DA Kv7.4通道表達(dá)與神經(jīng)元興奮性的關(guān)系。結(jié)果:我們的研究發(fā)現(xiàn)社交挫敗模型小鼠的抑郁樣行為與VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性增高有直接關(guān)系,這與此前的研究相似。我們進(jìn)一步研究了Kv7.4通道與社交挫敗模型小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性增高的關(guān)系。首先,我們利用糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、社交時(shí)間兩個(gè)指標(biāo)確定社交挫敗模型是否建立成功。社交挫敗敏感小鼠表現(xiàn)為糖水偏愛降低和社交時(shí)間減少,而沒有表現(xiàn)出糖水偏愛降低和社交時(shí)間減少的小鼠確定為社交挫敗非敏感小鼠。與此前報(bào)道相似,敏感小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元放電頻率明顯增高,而且與DA能神經(jīng)元生理功能關(guān)系更為密切的burst放電也明顯增多,而正常和非敏感小鼠沒有變化。另外為觀察Kv7.4通道是否與敏感小鼠DA能神經(jīng)元異常興奮有關(guān),我們測定了Kv7.4基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)敏感小鼠Kv7.4基因表達(dá)明顯減少,并且Kv7.4表達(dá)量的多少與DA能神經(jīng)元放電頻率呈明顯負(fù)相關(guān)。與基因表達(dá)相似,敏感小鼠VTA區(qū)Kv7.4蛋白表達(dá)量也明顯降低。結(jié)論:社交挫敗敏感小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性明顯增高,burst放電明顯增加;VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性與Kv7.4通道表達(dá)存在明顯負(fù)相關(guān)性。第三部分調(diào)節(jié)Kv7.4功能對社交挫敗小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性及抑郁樣行為的作用目的:觀察調(diào)節(jié)Kv7.4功能對社交挫敗小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性及抑郁樣行為的影響方法:利用在體電生理記錄方式觀察fasudil和RTG對社交挫敗敏感小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元放電頻率及burst放電的影響;利用社交箱觀察fasudil和RTG對社挫敗敏感小鼠社交時(shí)間的影響。結(jié)果:利用在體單單位(single unit)記錄模式,我們發(fā)現(xiàn)fasudil和RTG均可降低野生社交挫敗敏感小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元的放電頻率,特別是burst放電(burst放電數(shù)百分比、單個(gè)burst放電數(shù))也明顯減少。但是在Kv7.4敲除小鼠,fasudil卻沒有影響社交挫敗敏感小鼠DA能神經(jīng)元放電,但是RTG對DA能神經(jīng)元放電的仍有較小的影響。更重要的是在野生型社交挫敗敏感小鼠腹腔注射fasudil和RTG后,其社交時(shí)間明顯增加;與對神經(jīng)元放電的影響相同,在Kv7.4敲除小鼠,fasudil沒有影響社交挫敗敏感小鼠社交時(shí)間,而RTG則仍然有作用。需要提出的是RTG在影響小鼠社交行為的同時(shí)也對動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)有影響;通過開放曠場實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),腹腔注射RTG后不論野生型還是Kv7.4敲除小鼠,不論對照組還是社交挫敗敏感小鼠,其移動(dòng)速度均明顯減小,而fasudil對動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)則沒有明顯影響。結(jié)論:開放Kv7.4通道可明顯降低社交挫敗敏感小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元的興奮興特別是burst放電,并改善其抑郁樣行為。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.4

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本文編號(hào)：2520409