【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又稱老年性癡呆,是老年期的一種常見性疾病,其典型特征性的神經(jīng)病理改變是腦組織細(xì)胞外神經(jīng)炎性斑塊(senile plaques, SP)和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangle, NFT)。淀粉樣蛋白(Ap)是SP的主要成份,由淀粉樣肽前體蛋白(P amyloid protein precursor,APP)先后經(jīng)p-分泌酶和γ-分泌酶水解產(chǎn)生,但絕大多數(shù)的APP在a-分泌酶作用下通過非淀粉源途徑代謝釋放可溶性的sAPPa而阻止Ap的生成。另外,APP基因5'端調(diào)控區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合位點(diǎn)(APPκB位點(diǎn)),由NF-κB家族成員P50參入構(gòu)成的復(fù)合物可與APPκB結(jié)合位點(diǎn)特異結(jié)合而激活A(yù)PP的轉(zhuǎn)錄。抑制APP的生成和減少Aβ沉積是防治AD的關(guān)鍵,故影響APP基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和APP代謝為Aβ的分泌酶是治療AD的潛力靶點(diǎn)。 三七總皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)是中藥三七的主要活性成分,前期研究已證實(shí)PNS對(duì)老年性癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損害具有明顯改善作用,可抑制快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)APP和Aβ1-40、Aβ1-42的表達(dá),但PNS抑制快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)p淀粉樣蛋白及其前體蛋白表達(dá)的作用機(jī)理是仍不清楚。 目的：本課題將以快速老化癡呆模型小鼠SAMP8為動(dòng)物模型,觀察PNS對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦中直接影響APP生成量的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子和影響APP分解代謝為Ap相關(guān)分泌酶水平,弄清PNS影響Ap代謝途徑的部位和環(huán)節(jié),闡明PNS抑制Ap及其前體蛋白表達(dá)的作用機(jī)制,為開發(fā)PNS治療老年性癡呆提供更多的科學(xué)依椐。 方法： 1.將快速老化癡呆模型小鼠SAMP8隨機(jī)分為對(duì)照組、PNS高劑量組(200mg·kg-1)、低劑量組(100mg·kg-1)、石杉?jí)A甲組(0.03mg·kg-1),每組15只,另留10只(模型組)在給藥前進(jìn)行檢測(cè)記憶和行為檢測(cè),以檢驗(yàn)SAMP8模型是否成功。PNS和石杉?jí)A甲均以雙蒸水調(diào)配后灌胃給藥,對(duì)照組給予藥物組相同容積的雙蒸水。每天灌胃1次,連續(xù)給藥2個(gè)月。 2.利用Morris水迷宮方法和病理組織檢查聯(lián)合檢測(cè)PNS對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力影響和海馬神經(jīng)元損傷。 3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦中NF-κB轉(zhuǎn)錄因子P50、α-分泌酶ADAM (ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PSl和PS2mRNA進(jìn)行定量分析,了解上述基因的表達(dá)差異。 4.采用直接熒光法和ELISA法檢測(cè)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶的活性。 5.采用免疫組化和Western blot方法檢測(cè)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦NF-κB轉(zhuǎn)錄因子P50,α-分泌酶ADAM (ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PSl和PS2蛋白的表達(dá)水平。 6.采用HE染色法觀察快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦小膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)。 7.采用ELISA法檢測(cè)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8血清炎癥因子IL-1p的含量變化。結(jié)果： 第一章PNS對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶行為的影響 1. Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示,在定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練中,與藥物對(duì)照組相比,PNS組SAMP8的逃避潛伏期明顯縮短,尋求次數(shù)增多,停留時(shí)間延長,平臺(tái)象限百分比增大(P0.01或P0.05),5d變化趨勢(shì)圖顯示給藥組的逃避潛伏期、尋求次數(shù)、停留時(shí)間和平臺(tái)象限百分比變化幅度明顯,而藥物對(duì)照組變化緩和；空間探索實(shí)驗(yàn)亦顯示PNS組SAMP8的原平臺(tái)象限百分比、跨越原平臺(tái)次數(shù)、停留時(shí)間都比藥物對(duì)照組有所改善,說明PNS對(duì)SAMP8的學(xué)習(xí)記憶行為能力有改善作用,且隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長,PNS對(duì)SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用越明顯。模型組在各項(xiàng)指標(biāo)中均比對(duì)照組強(qiáng),說明隨著年齡的增加,SAMP8的學(xué)習(xí)記憶能力有所下降,表明SAMP8模型是成功的。 2.病理組織學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果顯示藥物對(duì)照組SAMP8海馬結(jié)構(gòu)異常,神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少,錐體細(xì)胞帶紊亂、變稀、中斷,同時(shí)可見許多細(xì)胞體積縮小,胞核固縮,染色加深；PNS組SAMP8的皮質(zhì)和海馬形態(tài)均有不同程度的恢復(fù),神經(jīng)元數(shù)量增多,細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)致密,形態(tài)較正常,分布比較均勻,胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和染色正常,表明PNS可減輕快速老化癡呆模型小鼠SAMP8海馬神經(jīng)元損傷。 第二章PNS減少快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦APP轉(zhuǎn)錄的機(jī)制研究 1.HE染色顯示對(duì)照組SAMP8的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大,染色深而不勻,胞體呈圓形無突起,成為激活型小膠質(zhì)細(xì)胞,PNS處理的SAMP8海馬區(qū)有散在未激活小膠質(zhì)細(xì)胞,染色淺而均勻,突觸細(xì)長,呈分支狀,周圍神經(jīng)細(xì)胞正常。 2. ELISA法檢測(cè)結(jié)果得知藥物干預(yù)SAMP8后,PNS(200mg·kg-1)能顯著降低SAMP8血清IL-1β的含量(P0.01),提示PNS能減少快速老化癡呆模型小鼠SAMP8血清中炎癥因子IL-1β的釋放。 3.由Real-time PCR結(jié)果可知,與對(duì)照組相比,PNS(200mg-kg"1)能降低SAMP8大腦NF-κB轉(zhuǎn)錄因子p50mRNA的含量(P0.05),提示PNS能下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦NF-κB轉(zhuǎn)錄因子p50mRNA的水平。 4. Westblot法和免疫組化法結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)明顯降低SAMP8大腦NF-κB轉(zhuǎn)錄因子p50蛋白相對(duì)灰度和免疫陽性細(xì)胞數(shù)(P0.01),提示PNS能下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦(?)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子p50蛋白的表達(dá)。 第三章PNS對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦β淀粉樣蛋白代謝路徑相關(guān)分泌酶的影響 1.直接熒光法結(jié)果顯示,α-分泌酶在樣品蛋白濃度為2mg·mL-1時(shí),藥物組的RFU值均比對(duì)照組高(P0.01),β-分泌酶在樣品蛋白濃度為3mg·mL-1時(shí),PNS組的RFU·μg-1值比對(duì)照組低(P0.01),提示PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)可上調(diào)SAMP8大腦α-分泌酶的活性,而降低β-分泌酶的活性;ELISA檢測(cè)證明PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)對(duì)SAMP8大腦γ-分泌酶的活性無顯著影響(P0.05)。 2. Real-time PCR檢測(cè)PNS對(duì)SAMP8大腦組織中α-分泌酶ADAM (ADAM10、 ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PS1和PS2mRNA表達(dá)的影響。 ①PNS (200mg·kg-1)能上調(diào)SAMP8大腦(?)ADAM9mRNA的表達(dá)(P0.01)；PNS(100mg·kg-1)可降低SAMP8大腦ADAM10和ADAM17mRNA的表達(dá),但PNS(200mg-kg-1)對(duì)(?)ADAM10和(?)ADAM17mRNA的表達(dá)無明顯影響(P0.05)。 ②PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能顯著降低SAMP8腦內(nèi)BACE1mRNA的表達(dá)(P0.01)。 ③PNS能顯著降低SAMP8腦內(nèi)Aph-1mRNA的含量(P0.05),但對(duì)PSl和PS2mRNA的表達(dá)無明顯影響(P0.05)。 3.免疫印跡和免疫組化技術(shù)檢測(cè)PNS對(duì)SAMP8大腦組織中a-分泌酶ADAM(ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PS1和PS2蛋白表達(dá)的影響。 ①PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)可上調(diào)SAMP8大腦ADAM9的蛋白表達(dá)而下調(diào)ADAM10的蛋白表達(dá)(P0.01), PNS (200mg·kg-1)還可下調(diào)ADAM17蛋白表達(dá)(P0.05)。 ②PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能降低SAMP8腦內(nèi)BACE1蛋白的表達(dá)(P0.01)。 ③PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能顯著降低SAMP8腦內(nèi)Aph-1蛋白含量(P0.01或P0.05),對(duì)PS2蛋白則是上調(diào)作用(P0.01),但對(duì)PS1蛋白的作用不明顯(P0.05)。 結(jié)論： 1.PNS對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8的學(xué)習(xí)記憶行為能力有改善作用,且隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長,PNS對(duì)SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用越明顯。 2.PNS可減輕快速老化癡呆模型小鼠SAMP8海馬神經(jīng)元損傷。 3.PNS可降低SAMP8大腦激活的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目,引起炎癥因子IL-1β的釋放減少,從而減輕APPκB結(jié)合位點(diǎn)活性的刺激；此外,減少的IL-1β可降低轉(zhuǎn)錄因子p50的表達(dá),從而降低其與輕APPκB結(jié)合位點(diǎn)活性的結(jié)合,最終導(dǎo)致APP基因轉(zhuǎn)錄減少。 4.PNS能從基因水平上上調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦ADAM9mRNA的表達(dá),從而提高ADAM9蛋白表達(dá),α-分泌酶的活性的升高可能由ADAM9上調(diào)所致。 5.PNS從基因和蛋白水平上下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)BACE1的水平,從而降低β-分泌酶的活性。 6.PNS能在基因和蛋白水平下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)Aph-1表達(dá),上調(diào)PS2蛋白表達(dá),對(duì)PSl蛋白表達(dá)無顯著影響,但PNS對(duì)Y-分泌酶活性無明顯影響可能是由于PNS對(duì)Aph-1、PS1和PS2綜合作用的結(jié)果。 本課題研究結(jié)果表明PNS既可以下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子P50的表達(dá)從而減少APP的生成,亦通過升高快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)α-分泌酶的活性,降低β-分泌酶活性而減少APP代謝為Aβ。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R285.5;R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2496395