發(fā)布時間：2019-06-10 10:30

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又稱老年性癡呆,是老年期的一種常見性疾病,其典型特征性的神經(jīng)病理改變是腦組織細胞外神經(jīng)炎性斑塊(senile plaques, SP)和細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(Neurofibrillary tangle, NFT)。淀粉樣蛋白(Ap)是SP的主要成份,由淀粉樣肽前體蛋白(P amyloid protein precursor,APP)先后經(jīng)p-分泌酶和γ-分泌酶水解產(chǎn)生,但絕大多數(shù)的APP在a-分泌酶作用下通過非淀粉源途徑代謝釋放可溶性的sAPPa而阻止Ap的生成。另外,APP基因5'端調(diào)控區(qū)存在轉錄因子NF-κB結合位點(APPκB位點),由NF-κB家族成員P50參入構成的復合物可與APPκB結合位點特異結合而激活APP的轉錄。抑制APP的生成和減少Aβ沉積是防治AD的關鍵,故影響APP基因表達的轉錄因子和APP代謝為Aβ的分泌酶是治療AD的潛力靶點。 三七總皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)是中藥三七的主要活性成分,前期研究已證實PNS對老年性癡呆模型大鼠空間學習記憶損害具有明顯改善作用,可抑制快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)APP和Aβ1-40、Aβ1-42的表達,但PNS抑制快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)p淀粉樣蛋白及其前體蛋白表達的作用機理是仍不清楚。 目的：本課題將以快速老化癡呆模型小鼠SAMP8為動物模型,觀察PNS對快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦中直接影響APP生成量的NF-κB轉錄因子和影響APP分解代謝為Ap相關分泌酶水平,弄清PNS影響Ap代謝途徑的部位和環(huán)節(jié),闡明PNS抑制Ap及其前體蛋白表達的作用機制,為開發(fā)PNS治療老年性癡呆提供更多的科學依椐。 方法： 1.將快速老化癡呆模型小鼠SAMP8隨機分為對照組、PNS高劑量組(200mg·kg-1)、低劑量組(100mg·kg-1)、石杉堿甲組(0.03mg·kg-1),每組15只,另留10只(模型組)在給藥前進行檢測記憶和行為檢測,以檢驗SAMP8模型是否成功。PNS和石杉堿甲均以雙蒸水調(diào)配后灌胃給藥,對照組給予藥物組相同容積的雙蒸水。每天灌胃1次,連續(xù)給藥2個月。 2.利用Morris水迷宮方法和病理組織檢查聯(lián)合檢測PNS對快速老化癡呆模型小鼠SAMP8學習記憶能力影響和海馬神經(jīng)元損傷。 3.采用實時熒光定量PCR技術對快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦中NF-κB轉錄因子P50、α-分泌酶ADAM (ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PSl和PS2mRNA進行定量分析,了解上述基因的表達差異。 4.采用直接熒光法和ELISA法檢測快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶的活性。 5.采用免疫組化和Western blot方法檢測快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦NF-κB轉錄因子P50,α-分泌酶ADAM (ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PSl和PS2蛋白的表達水平。 6.采用HE染色法觀察快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦小膠質(zhì)細胞的活動狀態(tài)。 7.采用ELISA法檢測快速老化癡呆模型小鼠SAMP8血清炎癥因子IL-1p的含量變化。結果： 第一章PNS對快速老化癡呆模型小鼠SAMP8學習記憶行為的影響 1. Morris水迷宮測試結果顯示,在定位航行實驗訓練中,與藥物對照組相比,PNS組SAMP8的逃避潛伏期明顯縮短,尋求次數(shù)增多,停留時間延長,平臺象限百分比增大(P0.01或P0.05),5d變化趨勢圖顯示給藥組的逃避潛伏期、尋求次數(shù)、停留時間和平臺象限百分比變化幅度明顯,而藥物對照組變化緩和；空間探索實驗亦顯示PNS組SAMP8的原平臺象限百分比、跨越原平臺次數(shù)、停留時間都比藥物對照組有所改善,說明PNS對SAMP8的學習記憶行為能力有改善作用,且隨著訓練時間的延長,PNS對SAMP8學習記憶能力的改善作用越明顯。模型組在各項指標中均比對照組強,說明隨著年齡的增加,SAMP8的學習記憶能力有所下降,表明SAMP8模型是成功的。 2.病理組織學檢驗結果顯示藥物對照組SAMP8海馬結構異常,神經(jīng)元細胞明顯減少,錐體細胞帶紊亂、變稀、中斷,同時可見許多細胞體積縮小,胞核固縮,染色加深；PNS組SAMP8的皮質(zhì)和海馬形態(tài)均有不同程度的恢復,神經(jīng)元數(shù)量增多,細胞排列整齊,結構致密,形態(tài)較正常,分布比較均勻,胞內(nèi)結構和染色正常,表明PNS可減輕快速老化癡呆模型小鼠SAMP8海馬神經(jīng)元損傷。 第二章PNS減少快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦APP轉錄的機制研究 1.HE染色顯示對照組SAMP8的小膠質(zhì)細胞胞體增大,染色深而不勻,胞體呈圓形無突起,成為激活型小膠質(zhì)細胞,PNS處理的SAMP8海馬區(qū)有散在未激活小膠質(zhì)細胞,染色淺而均勻,突觸細長,呈分支狀,周圍神經(jīng)細胞正常。 2. ELISA法檢測結果得知藥物干預SAMP8后,PNS(200mg·kg-1)能顯著降低SAMP8血清IL-1β的含量(P0.01),提示PNS能減少快速老化癡呆模型小鼠SAMP8血清中炎癥因子IL-1β的釋放。 3.由Real-time PCR結果可知,與對照組相比,PNS(200mg-kg"1)能降低SAMP8大腦NF-κB轉錄因子p50mRNA的含量(P0.05),提示PNS能下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦NF-κB轉錄因子p50mRNA的水平。 4. Westblot法和免疫組化法結果顯示,與對照組比較,PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)明顯降低SAMP8大腦NF-κB轉錄因子p50蛋白相對灰度和免疫陽性細胞數(shù)(P0.01),提示PNS能下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦(?)NF-κB轉錄因子p50蛋白的表達。 第三章PNS對快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦β淀粉樣蛋白代謝路徑相關分泌酶的影響 1.直接熒光法結果顯示,α-分泌酶在樣品蛋白濃度為2mg·mL-1時,藥物組的RFU值均比對照組高(P0.01),β-分泌酶在樣品蛋白濃度為3mg·mL-1時,PNS組的RFU·μg-1值比對照組低(P0.01),提示PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)可上調(diào)SAMP8大腦α-分泌酶的活性,而降低β-分泌酶的活性;ELISA檢測證明PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)對SAMP8大腦γ-分泌酶的活性無顯著影響(P0.05)。 2. Real-time PCR檢測PNS對SAMP8大腦組織中α-分泌酶ADAM (ADAM10、 ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PS1和PS2mRNA表達的影響。 ①PNS (200mg·kg-1)能上調(diào)SAMP8大腦(?)ADAM9mRNA的表達(P0.01)；PNS(100mg·kg-1)可降低SAMP8大腦ADAM10和ADAM17mRNA的表達,但PNS(200mg-kg-1)對(?)ADAM10和(?)ADAM17mRNA的表達無明顯影響(P0.05)。 ②PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能顯著降低SAMP8腦內(nèi)BACE1mRNA的表達(P0.01)。 ③PNS能顯著降低SAMP8腦內(nèi)Aph-1mRNA的含量(P0.05),但對PSl和PS2mRNA的表達無明顯影響(P0.05)。 3.免疫印跡和免疫組化技術檢測PNS對SAMP8大腦組織中a-分泌酶ADAM(ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PS1和PS2蛋白表達的影響。 ①PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)可上調(diào)SAMP8大腦ADAM9的蛋白表達而下調(diào)ADAM10的蛋白表達(P0.01), PNS (200mg·kg-1)還可下調(diào)ADAM17蛋白表達(P0.05)。 ②PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能降低SAMP8腦內(nèi)BACE1蛋白的表達(P0.01)。 ③PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能顯著降低SAMP8腦內(nèi)Aph-1蛋白含量(P0.01或P0.05),對PS2蛋白則是上調(diào)作用(P0.01),但對PS1蛋白的作用不明顯(P0.05)。 結論： 1.PNS對快速老化癡呆模型小鼠SAMP8的學習記憶行為能力有改善作用,且隨著訓練時間的延長,PNS對SAMP8學習記憶能力的改善作用越明顯。 2.PNS可減輕快速老化癡呆模型小鼠SAMP8海馬神經(jīng)元損傷。 3.PNS可降低SAMP8大腦激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)目,引起炎癥因子IL-1β的釋放減少,從而減輕APPκB結合位點活性的刺激；此外,減少的IL-1β可降低轉錄因子p50的表達,從而降低其與輕APPκB結合位點活性的結合,最終導致APP基因轉錄減少。 4.PNS能從基因水平上上調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8大腦ADAM9mRNA的表達,從而提高ADAM9蛋白表達,α-分泌酶的活性的升高可能由ADAM9上調(diào)所致。 5.PNS從基因和蛋白水平上下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)BACE1的水平,從而降低β-分泌酶的活性。 6.PNS能在基因和蛋白水平下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)Aph-1表達,上調(diào)PS2蛋白表達,對PSl蛋白表達無顯著影響,但PNS對Y-分泌酶活性無明顯影響可能是由于PNS對Aph-1、PS1和PS2綜合作用的結果。 本課題研究結果表明PNS既可以下調(diào)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)NF-κB轉錄因子P50的表達從而減少APP的生成,亦通過升高快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦內(nèi)α-分泌酶的活性,降低β-分泌酶活性而減少APP代謝為Aβ。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R285.5;R749.16

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 袁玉紅;益腎健腦湯治療老年性癡呆臨床觀察[J];北京中醫(yī);2001年04期

2 涂榮波;董軍;;β-淀粉樣蛋白在老年癡呆癥發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制[J];第四軍醫(yī)大學學報;2007年01期

3 劉劍鋼;;補腎化痰逐瘀法治療老年性癡呆31例分析[J];光明中醫(yī);2006年11期

4 方芳,晏勇;老年性癡呆動物模型研究[J];國外醫(yī)學.神經(jīng)病學神經(jīng)外科學分冊;2004年05期

5 劉靖 ,王林;美金剛在美國獲準用于治療阿爾茨海默病[J];國外醫(yī)學(藥學分冊);2004年02期

6 曹玉笈 ,劉珍華;益氣活血化痰法治療老年性癡呆癥36例[J];國醫(yī)論壇;2004年03期

7 范聚友;;哈伯因治療阿爾茨海默病的療效觀察[J];中國實用神經(jīng)疾病雜志;2006年03期

8 申芳芳;趙根祥;吳敏;;老年癡呆癥藥物治療進展[J];神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生;2006年03期

9 馮榮芳;馮亞青;呂佩源;;阿爾茨海默病動物模型研究進展[J];腦與神經(jīng)疾病雜志;2008年06期

10 屈澤強,謝智光,王乃平,鮑運平,鐘振國;三七總皂苷抗衰老作用的實驗研究[J];廣州中醫(yī)藥大學學報;2005年02期

，

本文編號：2496395