【摘要】：阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種進(jìn)行性、不可逆轉(zhuǎn)的大腦(特別是皮層和海馬)神經(jīng)元損失的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以認(rèn)知障礙、記憶損害和人格改變?yōu)橹饕R床特征。神經(jīng)病理改變以細(xì)胞外老年斑(senile plaque,SP).腦細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)以及大量神經(jīng)元丟失為主要特征。隨著人口老齡化,AD患者數(shù)量急劇上升,明確AD的發(fā)病機(jī)理,對解決人口老齡化帶來的一系列問題至關(guān)重要。 作為老年斑的主要組成成分,β淀粉樣蛋白(Amyloid β protein,Aβ)由淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)經(jīng)β-和γ-分泌酶共同剪切形成。老年斑中Aβ主要以Aβ1-40和Aβ1-42兩種形式存在,Aβ1-42從時程和量程上均表現(xiàn)出比Aβ1-40更強(qiáng)的毒性。 Aβ從產(chǎn)生、聚集、到發(fā)揮神經(jīng)毒性要經(jīng)歷以下5個環(huán)節(jié)：APP基因→APPmRNA→APP蛋白質(zhì)→Aβ多肽→Aβ多肽聚集。目前的研究認(rèn)為,APP基因在DNA水平的變異是造成Aβ增加的重要原因,但這只能解釋占AD總數(shù)1%左右的家族性AD(Familial AD,FAD)的發(fā)病機(jī)制,因為在絕大多數(shù)散發(fā)性AD(Sporadic AD)患者中,都未發(fā)現(xiàn)APP基因的變異。 我們實驗室長期從事RNA氧化與衰老相關(guān)疾病的分子機(jī)制研究。RNA氧化最主要的產(chǎn)物是8-氧化鳥苷(8-oxo-7,8-dihydroguanosine,8-oxoG),8-oxoG既可以與DNA模板上的胞嘧啶(Cytocine,C)配對,也可以與腺嘌呤(Adenine,A)配對,引起轉(zhuǎn)錄錯誤,產(chǎn)生序列變異的蛋白質(zhì),基因組DNA信息將不能準(zhǔn)確的傳遞給蛋白質(zhì)。 1999年,有研究者發(fā)現(xiàn),AD患者大腦RNA氧化產(chǎn)物8-oxoG明顯增高,且與病情進(jìn)展有明確的相關(guān)性。為了驗證這一結(jié)果,2008年,我們采用免疫組化方法開展了快速老化小鼠(Senescence-accelerated mice prone8,SAMP8)和其正常對照(Senescence-accelerated mice resistant1,SAMRl)鼠的大腦神經(jīng)細(xì)胞中DNA和RNA氧化水平的研究。結(jié)果顯示：SAM鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞DNA中8-oxodG和RNA中8-oxoG呈現(xiàn)增齡性增加,且同月齡的P8鼠高于R1。隨后,我們完成了AD患者尸檢海馬組織的免疫組化研究,與同齡正常對照者相比,AD患者海馬細(xì)胞核中8-oxodG含量和胞漿中8-oxoG含量均顯著增加。 免疫組化結(jié)果受實驗者的主觀影響較大,僅靠灰度定量,無法準(zhǔn)確評估RNA氧化程度。本研究中,我們建立了準(zhǔn)確度和靈敏度更高的高效液相色譜—三重四級桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)串聯(lián)檢測體系,并運用該體系檢測了SAMP8和SAMR1小鼠各個臟器,包括大腦、肺、心臟、肝臟、腎臟和睪丸的DNA和RNA氧化水平,以及血漿和尿液中DNA和RNA氧化代謝物的濃度。我們的檢測結(jié)果再次確認(rèn)了核酸氧化,特別是RNA氧化與SAMP8鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的相關(guān)性。我們還發(fā)現(xiàn),尿液8-oxoG的含量遠(yuǎn)高于血漿8-oxodG、血漿8-oxoG以及尿液8-oxodG,有可能是評價機(jī)體氧化損傷的較好的生物學(xué)標(biāo)志物。 基于此,我們假設(shè)：APP基因的mRNA因氧化而引起基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程改變,造成APP蛋白的氨基酸序列改變。變異的APP蛋白經(jīng)病理性的β、γ水解途徑,產(chǎn)生更多種類和量的Aβ片段,繼而聚集形成老年斑,啟動AD的病理學(xué)過程。 為了驗證這一設(shè)想,我們在細(xì)胞水平開展了以下實驗：在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人APP基因,同時采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)敲減RNA氧化抑制基因MTH1,成功構(gòu)建CHO_APP_iMTHl單克隆細(xì)胞株。我們在此細(xì)胞培養(yǎng)基中添加8-oxoGTP (8-oxo-7,8-dihydroguanosine5-triphosphate,8-氧化鳥苷三磷酸)。在RNA轉(zhuǎn)錄過程中,8-oxoGTP可與GTP競爭性地?fù)饺隦NA鏈,引起RNA氧化增加。通過采用ELISA技術(shù)檢測培養(yǎng)基中Aβ1-x、Aβ40和Aβ42的濃度,我們發(fā)現(xiàn),RNA氧化使單個細(xì)胞分泌的上述3種多肽顯著增加(P0.05)。借助MALDI-TOF和Q-TOF等質(zhì)譜技術(shù),我們觀察了加壓之后Ap在種類和量上的變化。將檢測結(jié)果與Aβ野生型片段譜數(shù)據(jù)庫比對,我們發(fā)現(xiàn)con組培養(yǎng)基中的Ap片段有69種,而oxo組培養(yǎng)基中的Ap片段有108種。通過內(nèi)標(biāo)校正定量,我們發(fā)現(xiàn)oxo組大部分Ap表達(dá)量都增加。 同時,我們在動物水平開展了以下實驗：我們以8月齡SAMR1和SAMP8小鼠為模型,分為R1con組和R1oxo組,P8con和P8oxo組。通過側(cè)腦室和尾靜脈注射納米材料包裹的8-oxoGTP,造成全身各臟器,特別是大腦RNA氧化水平增加。注射2個月之后,我們觀察了SAM鼠行為學(xué)指標(biāo)(包括Morris水迷宮、新物體識別、平衡桿實驗、曠場實驗)的改變。結(jié)果顯示：水迷宮實驗中,注射8-oxoGTP的R1小鼠找到平臺的潛伏期顯著長于R1con組(P0.05),但P8鼠的con組和oxo組在水迷宮的測試結(jié)果上差別不明顯。在新物體識別、平衡桿實驗和曠場實驗中,oxo組與con組的表現(xiàn)沒有明顯區(qū)別。該結(jié)果提示RNA氧化可引起R1鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。由于P8鼠在檢測時衰老程度已經(jīng)非常嚴(yán)重,且受到其它疾病的干擾,導(dǎo)致檢測結(jié)果無規(guī)律可循。 綜上,本研究在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)RNA氧化增加導(dǎo)致Ap蛋白生成增多,在動物水平發(fā)現(xiàn)RNA氧化增加可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降,表明RNA氧化所造成的變異蛋白產(chǎn)生可能是阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制之一。目前動物實驗還在進(jìn)行中,我們計劃在注射4個月之后,采用PET-CT觀察AB斑塊的形成情況。并采用免疫組化技術(shù),觀察大腦組織(特別是海馬區(qū))Aβ1-x、Aβ40和Aβ42的表達(dá)情況,從影像學(xué)和病理學(xué)兩個方面進(jìn)一步確定RNA氧化在Ap產(chǎn)生和AD發(fā)病中的作用。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋曉寧;鄭君德;劉東戈;黑愛蓮;蔡劍平;;MTH2蛋白與8-氧鳥嘌呤脫氧核苷在阿爾茨海默病患者海馬組織中的表達(dá)變化[J];中日友好醫(yī)院學(xué)報;2009年05期

2 宋曉寧;鄭君德;林靜;蔡劍平;;8-oxo-G在快速老化小鼠SAMP8海馬中表達(dá)的增齡性變化研究[J];中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2008年02期

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本文編號：2477400