【摘要】：精神分裂癥斷裂基因1(Disrupted-In-Schizophrenia1，DISC1)被認(rèn)為是精神分裂癥發(fā)病的主要易感因素之一，其發(fā)現(xiàn)是在一個(gè)大樣本的蘇格蘭家系中精神分裂癥患者出現(xiàn)1號(hào)和11號(hào)染色體發(fā)生平衡異位(1；11)(q42.1；q14.3)。正常人類DISC1基因位于1號(hào)染色體q14.3，含有13個(gè)外顯子，共編碼854個(gè)氨基酸，其蛋白約93.6KD。DISC1氨基酸序列包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，能夠與200多個(gè)蛋白分子相互作用，直接或間接的參與多個(gè)信號(hào)通路。研究該基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能作用對(duì)精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制及臨床診治具有重要意義。目前關(guān)于腦內(nèi)DISC1功能的認(rèn)識(shí)多集中在其對(duì)神經(jīng)元(Neuron)作用的研究，如DISC1可調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移、軸突生長(zhǎng)、突觸傳遞和控制發(fā)育大腦中神經(jīng)元過度整合等等。而作為腦內(nèi)更多數(shù)量的保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)和支持神經(jīng)元的膠質(zhì)細(xì)胞(Glial Cell)，如星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AST)和參與髓鞘形成少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocyte，OL)等，，DISC1對(duì)它們的作用認(rèn)識(shí)還鮮有報(bào)道。 近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥病人經(jīng)常伴隨有腦白質(zhì)發(fā)育異常，包括胼胝體發(fā)育不全和側(cè)腦室擴(kuò)大等病理結(jié)構(gòu)改變，而結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期系列研究也說明腦白質(zhì)異常參與了精神分裂癥的發(fā)病。為此我們推測(cè)DISC1可能參與了大腦白質(zhì)發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，其作用可能通過調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)或星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)的發(fā)育或功能來實(shí)現(xiàn)。 因此本研究我們首先利用體外分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendroglia precursor cell，OPC)及分化成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)以及出生后腦白質(zhì)發(fā)育模型，檢測(cè)DISC1的表達(dá)；進(jìn)而利用從胼胝體區(qū)克隆出來的全長(zhǎng)DISC1基因序列，構(gòu)建DISC1-GFP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染少突膠質(zhì)細(xì)胞系以及星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察其對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞系(Oli-neu)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。最后利用DISC1基因突變小鼠(L100P)，分離培養(yǎng)AST；觀察DISC1基因突變后對(duì)AST細(xì)胞形態(tài)及鈣信號(hào)途徑的影響。 本研究總共分為三部分； 第一部分： DISC1基因在膠質(zhì)細(xì)胞和腦白質(zhì)不同發(fā)育階段的表達(dá) 體外分離培養(yǎng)AST、OPC和OL細(xì)胞，利用Q-PCR、WB及ICC檢測(cè)各膠質(zhì)細(xì)胞中DISC1表達(dá)。 進(jìn)一步通過Q-PCR及Western Blot檢測(cè)P0、P7、P15、P21和成年的SD大鼠腦內(nèi)胼胝體和視神經(jīng)的DISC1表達(dá)情況。 主要結(jié)果如下： 1、體外分離培養(yǎng)的AST、OPC和OL細(xì)胞都有DISC1表達(dá)，與陽(yáng)性對(duì)照的腦組織以及分離培養(yǎng)的NSC條帶大小一致；并且在離體情況下DISC1在OPC和OL中的表達(dá)明顯強(qiáng)于AST。 2、在不同發(fā)育階段，腦白質(zhì)胼胝體和視神經(jīng)內(nèi)DISC1基因總體表達(dá)量首先呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，隨后表達(dá)上調(diào)(P0.05)；Q-PCR結(jié)果與Western Blot結(jié)果趨勢(shì)基本一致(P0.05)。 3、DISC1蛋白為雙帶，不同發(fā)育階段的胼胝體和視神經(jīng)，分子量大的重鏈隨著發(fā)育成熟， DISC1表達(dá)逐漸下調(diào)(P0.05)，而分子量小的輕鏈，表達(dá)則呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)(P0.05)。 以上結(jié)果說明，隨著大腦白質(zhì)的發(fā)育成熟，DISC1表達(dá)存在明顯差異。DISC1可能對(duì)大腦白質(zhì)的發(fā)育分化起到重要作用，并且這種作用可能是通過對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用來實(shí)現(xiàn)的。 第二部分：腦白質(zhì)DISC1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 利用分子克隆等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，構(gòu)建腦白質(zhì)胼胝體DISC1表達(dá)質(zhì)粒，通過基因測(cè)序及轉(zhuǎn)染AST和Oli-neu少突膠質(zhì)細(xì)胞系鑒定質(zhì)粒表達(dá)蛋白，并觀察檢測(cè)對(duì)Oli-neu和AST細(xì)胞的影響。 主要結(jié)果如下： 1、成功從小鼠胼胝體區(qū)提取RNA，通過高保真酶從小鼠胼胝體cDNA成功擴(kuò)增出DISC1開放閱讀框約2500bp序列。 2、DISC1開放閱讀框序列成功連接到pEGFP-n1表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果顯示連接在載體上的目的片段2556bp，無(wú)突變位點(diǎn)并能夠正確編碼翻譯DISC1蛋白。 3、轉(zhuǎn)染Oli-neu少突膠質(zhì)細(xì)胞系，Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白PDGFRα和MBP表達(dá)影響并不明顯。轉(zhuǎn)染AST后發(fā)現(xiàn)其胞體變大，質(zhì)膜伸展面積明顯比對(duì)照組增多。在等量GFP的情況下，AST細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的GFAP和β-acting比對(duì)照明顯上調(diào)(P0.05)。 本部分結(jié)果說明DISC1高表達(dá)后對(duì)AST的形態(tài)和功能有明顯影響。 第三部分：DISC1突變對(duì)AST形態(tài)和鈣信號(hào)途徑的影響的初步觀察 采用DISC1基因突變小鼠(L100P)，分離培養(yǎng)AST；觀察DISC1基因突變后對(duì)AST細(xì)胞形態(tài)及鈣信號(hào)途徑的影響。 主要結(jié)果如下： 1、DISC1基因(L100P)突變后，AST細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比明顯異常，細(xì)胞變大、邊緣變圓；細(xì)胞突起回縮、不明顯(P0.05)。 2、DISC1(L100P)突變AST，在5mM K+刺激下敏感性顯著增加，鈣釋放顯著增強(qiáng)，出現(xiàn)次級(jí)鈣震蕩波(p0.05)；突變組鈣釋放強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組。 3、Q-PCR結(jié)果顯示DISC1突變的AST內(nèi)DISC1表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)鈣通道蛋白R(shí)yR3蛋白的表達(dá)量增加(P0.05)。 以上結(jié)果說明DISC1是維持AST的功能作用的主要因素之一；同時(shí)提示DISC1基因異常所引起的AST功能受損可能是精神分裂癥發(fā)病的又一原因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R749.3

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8 鄧

本文編號(hào)：2414191