【摘要】：研究背景與目的 血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是一組由腦血管疾病導(dǎo)致的智能及認(rèn)知功能障礙綜合征,是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的引起癡呆的第二大最常見原因。Bowler等學(xué)者在90年代提出了血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment,VCI)的概念,以期在腦血管病的早期階段發(fā)現(xiàn)輕度的認(rèn)知功能障礙,制定合適的治療方案,延緩癡呆的發(fā)展進(jìn)程。VCI這一概念幾乎包含了腦血管疾病(cerebrovascular disease,CVD)對(duì)認(rèn)知功能影響的方方面面,涵蓋了早期階段認(rèn)知功能某一方面如語言的輕度障礙到廣泛認(rèn)知功能損害的癡呆綜合征。隨著我國老齡化人口的快速進(jìn)展,VaD的發(fā)病率和患病率明顯增加,給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān),但迄今為止,其發(fā)病機(jī)制尚不明確,故缺乏有效的預(yù)防和治療手段。因此,積極地探索和研究VaD的發(fā)病機(jī)理已成為當(dāng)務(wù)之急。 目前的研究結(jié)果表明,VaD的藥物治療及預(yù)防效果不明確。研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物并沒有提高腦缺血患者的腦血管反應(yīng)性。另外,與安慰劑相比,阿司匹林和降壓藥對(duì)癡呆的發(fā)生發(fā)展并沒有明顯的延緩作用。相比與藥物治療,近幾十年基于干細(xì)胞技術(shù)的細(xì)胞替代治療引起了廣泛的關(guān)注。在一項(xiàng)研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)通過對(duì)腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ挽o脈輸注人類骨髓CD34+干細(xì)胞,可以促進(jìn)缺血病灶周圍新生血管的形成,同時(shí)也促進(jìn)了內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞的遷移、成熟和功能性恢復(fù)。外源性干細(xì)胞替代治療為腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)提供了廣闊的前景,但是對(duì)于其應(yīng)用于臨床治療還需更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持,特別是長期的安全性和細(xì)胞采集以及輸注等技術(shù)性關(guān)鍵問題還有待于進(jìn)一步的研究。 近年來,國內(nèi)外的研究表明許多因素可以影響成年腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)再生,些生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)可以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、遷移、分化和存活,改善腦缺血等損傷所致的神經(jīng)功能障礙,為今后利用內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞作為細(xì)胞替代治療提供了可能,可以避免外源性細(xì)胞替代治療所帶來的安全性考慮和技術(shù)性難題。 腦缺血后海馬和側(cè)腦室的神經(jīng)再生是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn),對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的存活、增殖和分化的基因調(diào)控的研究是該領(lǐng)域研究的核心問題。國內(nèi)外的研究報(bào)道稱,中藥湯劑(人參養(yǎng)榮湯)、左旋丁苯酞、蒿本內(nèi)酯等能促進(jìn)海馬齒狀回(Dentate gyrus,DG)的顆粒細(xì)胞層下區(qū)(Subgranular zone,SGZ)的神經(jīng)再生,使雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)(bilateral permanent occlusion of the common carotid arteries,2VO)所致大鼠慢性腦缺血模型Morris水迷宮測(cè)試潛伏期顯著縮短,從而改善慢性腦缺血所致認(rèn)知功能障礙。雖然海馬神經(jīng)祖細(xì)胞可以從SGZ向顆粒細(xì)胞層遷移,但海馬新生神經(jīng)元在早期就到達(dá)它們最終的位置,新生細(xì)胞最遠(yuǎn)的遷移距離在50-100um范圍內(nèi),而大部分似乎根本不遷移,仍然停留在SGZ,不能直接參與海馬CA1神經(jīng)元損傷修復(fù)。因此國內(nèi)外的研究加強(qiáng)了對(duì)遷移能力較強(qiáng)的側(cè)腦室背外側(cè)壁的室下區(qū)(Subventricular zone,SVZ)的神經(jīng)祖細(xì)胞的研究。 以往研究表明,在正常嚙齒動(dòng)物的大腦,SVZ新生神經(jīng)元大部分都凋亡了,存活下來的新生神經(jīng)元沿著RMS(rostral migratory stream)遷移路徑到達(dá)嗅球,并分化為球旁細(xì)胞和GABAergic顆粒細(xì)胞。但在腦缺血等損傷刺激下,側(cè)腦室下區(qū)的神經(jīng)祖細(xì)胞可以明顯增多,并且可以向損傷部位遷移,分化為損傷部位的特定的神經(jīng)元,但腦缺血等損傷所致的微環(huán)境的變化使得新生神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)生長障礙,不能有效地整合入損傷部位的神經(jīng)電路參與功能修復(fù),但這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的生長障礙可以在FGF-2等生長因子干預(yù)下恢復(fù),提示腦缺血后功能缺陷的新生神經(jīng)元能在外源性因素干預(yù)下恢復(fù)正常結(jié)構(gòu),并發(fā)揮功能性作用,改善腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙。因此急需尋找有效的手段促進(jìn)SVZ神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,提高其存活率,促進(jìn)新生神經(jīng)元向損傷部位遷移,從而增加利用內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞作為細(xì)胞替代治療的機(jī)會(huì),有效地改善損傷所致的神經(jīng)功能障礙。 血管性癡呆(VaD)患者血清三碘甲狀腺原氨酸(T3)和游離三碘甲狀腺原氨酸(fT3)濃度顯著低于未癡呆患者,而且輕、中、重度不同程度血管性癡呆患者之間血清T3和fT3水平也有顯著差異,與阿爾茨海默病(AD)患者相比,VaD患者的f13水平也顯著降低,非癡呆型血管性認(rèn)知障礙(VCIND)患者的血清四碘甲狀腺原氨酸(T4)和游離四碘甲狀腺原氨酸(fT4)水平顯著低于腦血管疾病(CVD)患者,CVD患者的血清T4和fI'4水平顯著低于具有腦血管病危險(xiǎn)因素的正常對(duì)照組,以上研究結(jié)果共同提示,血清甲狀腺激素水平的異常與血管性癡呆的進(jìn)行性發(fā)展過程密切相關(guān),而且可能在腦血管病發(fā)生但未導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的早期階段就有血清甲狀腺激素水平的異常,加強(qiáng)甲狀腺激素與血管性癡呆之間關(guān)系以及機(jī)制等進(jìn)一步的研究很有意義,可能為今后血管性癡呆的早期臨床診斷和治療提供線索。 甲狀腺激素(THs)對(duì)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟至關(guān)重要,影響胚胎腦內(nèi)神經(jīng)元的增殖、分化,軸樹突生長,髓鞘形成等各個(gè)過程。近年來THs對(duì)成年大腦的影響備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)THs水平異常嚴(yán)重影響成年大腦SGZ和SVZ兩個(gè)區(qū)域神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、遷移、分化等過程,提示成年甲狀腺功能低下所致的認(rèn)知功能障礙可能與THs影響SGZ和SVZ兩個(gè)區(qū)域的神經(jīng)再生有關(guān)。多項(xiàng)研究通過對(duì)基因敲除模型和MMI/PTU導(dǎo)致的甲狀腺功能低下模型的研究發(fā)現(xiàn),不管是在胚胎和幼年大腦,還是對(duì)于成年大腦而言,甲狀腺素的缺乏可以影響神經(jīng)元的增殖、分化、遷移和凋亡等各個(gè)方面,使軸突樹突生長、突觸形成和髓鞘形成等過程受損,而重新補(bǔ)充甲狀腺激素可以逆轉(zhuǎn)甲狀腺素缺乏的負(fù)性作用,但甲狀腺激素(THs)對(duì)腦缺血后SVZ神經(jīng)再生的影響未見報(bào)道。 課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性腦缺血大鼠腦組織T3和T4濃度顯著下降,外源性補(bǔ)充甲狀腺素能顯著提高腦組織T3和T4的濃度,明顯縮短慢性腦缺血大鼠Morris水迷宮的潛伏期,改善其學(xué)習(xí)記憶能力；進(jìn)一步對(duì)慢性腦缺血大鼠第7天腹腔注射T3短期干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室下區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加,提示T3可促進(jìn)SVZ神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖,但長期作用對(duì)慢性腦缺血大鼠側(cè)腦室下區(qū)的神經(jīng)再生的影響尚不清楚。本課題擬采用成年大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)制備慢性腦缺血致血管性認(rèn)知障礙的動(dòng)物模型,對(duì)慢性腦缺血大鼠設(shè)置三碘甲狀腺原氨酸(T3)連續(xù)7天和14天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的干預(yù)處理,通過腹腔注射BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞,選擇內(nèi)源性細(xì)胞標(biāo)記物DCX,通過BrdU和DCX免疫熒光雙重標(biāo)記側(cè)腦室下區(qū)新生的未成熟神經(jīng)元,同時(shí)采用免疫印跡法檢測(cè)側(cè)腦室下區(qū)DCX蛋白的表達(dá)水平,觀察T3對(duì)SVZ神經(jīng)再生的影響。 研究方法 1.實(shí)驗(yàn)分組：48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,2VO組和缺血后三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)干預(yù)組,每組8只。2VO組采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)(2VO)制備慢性腦缺血致血管性認(rèn)知障礙動(dòng)物模型。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外,其余與慢性腦缺血組手術(shù)過程相同。缺血后T3干預(yù)組于雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后次日起給予T3,10ug/30g BodyWeight,1次/天,連續(xù)注射7天和14天后,分別處死。假手術(shù)組和2VO組大鼠給予腹腔注射生理鹽水,劑量同T3干預(yù)組,1次/天,連續(xù)注射7天和14天后,分別處死。術(shù)后各組大鼠連續(xù)腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)標(biāo)記增殖細(xì)胞,50mg/kg BodyWeight,2次／天,連續(xù)7天。 2.各組5只大鼠分別于第7、14天灌注取腦組織,采用BrdU與Doublecortin(DCX)免疫熒光雙染法標(biāo)記新生神經(jīng)元； 3.各組3只大鼠分別于第7、14天取新鮮腦組織冰上分離SVZ,采用免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)DCX蛋白的表達(dá)水平。 4.免疫熒光染色計(jì)數(shù)以一個(gè)對(duì)實(shí)驗(yàn)分組全盲的觀察者對(duì)SVZ BrdU/DCX陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果為主。每組5只大鼠,每只大鼠隔8張切片留取1張進(jìn)行染色,每只大鼠共計(jì)數(shù)6張切片的細(xì)胞數(shù),細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)的8倍作為最后細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差(one-way ANOVA)分析,組間多重比較采用LSD法,以P0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 研究結(jié)果 1.免疫熒光雙重染色可見缺血7天后,假手術(shù)組、2VO組和T3干預(yù)組BrdU、DCX陽性細(xì)胞都在SVZ表達(dá),沿SVZ分布,三組都可見部分BrdU陽性細(xì)胞不表達(dá)DCX,部分DCX陽性細(xì)胞也不表達(dá)BrdU。缺血后T3干預(yù)組BrdU和BrdU/DCX陽性細(xì)胞與假手術(shù)組和2VO組相比,在側(cè)腦室的表達(dá)增多。免疫印跡法顯示T3給藥7天后：與假手術(shù)組比較,2VO組、缺血后T3干預(yù)組DCX蛋白水平三組間呈遞增趨勢(shì),缺血后T3干預(yù)組增多明顯。 2.缺血14天后,免疫熒光雙重染色顯示：T3干預(yù)組與假手術(shù)組和2VO組相比,缺血后T3干預(yù)組BrdU和BrdU/DCX陽性細(xì)胞在側(cè)腦室的表達(dá)仍增多。2VO14天組BrdU.DCX熒光強(qiáng)度較2VO7天組顯著減弱；免疫印跡法顯示2VO組DCX蛋白水平降低較明顯,缺血后T3干預(yù)組DCX蛋白表達(dá)仍高于假手術(shù)組和2VO組。 3.為了進(jìn)一步量化各組間的差異,我們對(duì)免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示,缺血7天后,T3干預(yù)組BrdU陽性細(xì)胞較假手術(shù)組顯著增多(P=0.002),較2VO組增多,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.084)。缺血14天后,T3干預(yù)組與假手術(shù)組和2VO14天組相比,BrdU陽性細(xì)胞顯著增多(P0.01)。2VO14天組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)降低到2VO7天組的58.2%,兩組相比有顯著性差異(P=0.013)。缺血后T3干預(yù)14天組與缺血后T3干預(yù)7天組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)無顯著性差異。 4.我們對(duì)BrdU/DCX雙重?zé)晒鈽?biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示,假手術(shù)組、2VO7天組、缺血后T3干預(yù)7天組BrdU/DCX陽性細(xì)胞數(shù)分別為1502.4±252.6,2636.8±364.6,4316.8±529.9個(gè),組間比較有顯著性差異(F=12.60,P=0.001),缺血后T3干預(yù)7天組較2VO7天組和假手術(shù)組顯著增多(P=0.012,P0.001)。與假手術(shù)組和2VO14天組相比,缺血后T3干預(yù)14天組BrdU/DCX陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P0.001)。2V014天組BrdU/DCX陽性細(xì)胞為2V07天組的54.0%,兩組相比有顯著性差異(P=0.008)。缺血后T3干預(yù)14天組與缺血后T3干預(yù)7天組BrdU/DCX陽性細(xì)胞無顯著性差異。 研究結(jié)論 1.在本實(shí)驗(yàn)中,缺血7天后,T3干預(yù)組SVZ BrdU/DCX陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組和2VO7天組顯著增多,雖然腦缺血損傷也能刺激SVZ BrdU陽性細(xì)胞和BrdU/DCX陽性細(xì)胞的增多,但這種代償作用與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示了外源性補(bǔ)充甲狀腺激素進(jìn)一步促進(jìn)了腦缺血后SVZ新生神經(jīng)元的增殖。 2.缺血14天后,2VO組SVZ BrdU陽性細(xì)胞和BrdU/DCX陽性細(xì)胞與T3干預(yù)14天組和2VO7天組相比明顯減少,而缺血后T3干預(yù)14天組與缺血后T3干預(yù)7天組相比無顯著性差異,這一結(jié)果說明,慢性腦缺血后給予T3能明顯提高BrdU陽性細(xì)胞和BrdU/DCX陽性細(xì)胞的存活率,增加利用內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞作為細(xì)胞替代治療的可能性,進(jìn)一步為腦缺血損傷后功能修復(fù)創(chuàng)造機(jī)會(huì)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 林廣君;高政;羅冬冬;孫文芳;;非癡呆型血管性認(rèn)知障礙與甲狀腺功能的關(guān)系[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2012年22期

2 劉勇;劉建新;;腦的神經(jīng)再生[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年02期

3 劉海云;王群;陸兵勛;;慢性腦缺血大鼠腦組織T4-5’-脫碘酶及甲狀腺激素的變化[J];中國臨床康復(fù);2006年22期

4 趙斌;章軍建;王世鳳;陳光輝;胡發(fā)云;;血管性癡呆患者甲狀腺功能及血漿同型半胱氨酸水平[J];中國臨床康復(fù);2006年38期

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本文編號(hào)：2391491