發(fā)布時間：2018-12-10 17:08

【摘要】：研究背景阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,是老年人中常見的一種癡呆癥。AD的病理學(xué)特征主要包括腦中神經(jīng)細(xì)胞外8-淀粉樣多肽(β-amyloid peptide, Aβ)的沉積導(dǎo)致的老年斑,細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化Tau蛋白導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)細(xì)胞元細(xì)胞的缺失營養(yǎng)壞死。 近年來的研究表明,采用Aβ抗原的主動免疫刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫Aβ抗體,不僅抑制了腦中Aβ纖維斑塊的形成,還可明顯地改善實(shí)驗(yàn)鼠的行為和認(rèn)知障礙。免疫接種疫苗清除Aβ,有可能從根本上阻止和逆轉(zhuǎn)AD的病理過程,為預(yù)防和治療AD的研究提供新的思路。但是AD主動免疫的臨床Ⅱ期研究中發(fā)現(xiàn)有6%的研究對象出現(xiàn)了腦炎反應(yīng)的毒副作用,目前導(dǎo)致這種腦炎的具體原因尚不清楚,但相關(guān)的研究提示腦炎的發(fā)生可能是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)的結(jié)果,Q521佐劑的作用可能參與了腦炎副作用的發(fā)生過程。因此,尋找安全而且可靠的佐劑成為AD主動免疫治療研究的一個重要方面。 霍亂毒素B亞單位(cholera toxin B subunit, CB)是霍亂弧菌產(chǎn)生的外毒素B亞單位,能與所有有核細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside, GM1)受體結(jié)合,具有加強(qiáng)抗原表位抗原性的特點(diǎn)[15]。CB可以作為粘膜免疫佐劑,用于強(qiáng)化多糖、小肽等半抗原,可以增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的反應(yīng)(Th2反應(yīng)),刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體,而且不刺激產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)(Th1反應(yīng))。CB在AD免疫研究中可以作為一種安全的佐劑使用于Ap疫苗免疫。除CB外,鋁佐劑(AL)同樣能夠抑制Th1反應(yīng),是一種臨床上常用的安全佐劑。因此,AL同樣可以被選用于AD疫苗。選用CB、AL佐劑有可能可以降低AD免疫研究中出現(xiàn)的腦炎副作用。 鼻粘膜在抗原的刺激下能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫為主的反應(yīng),而且采用鼻粘膜免疫的方式,操作簡便,便于多次加強(qiáng)免疫。本實(shí)驗(yàn)在充分考慮了佐劑安全性的基礎(chǔ)上,選擇具有良好安全性的CB、AL佐劑,配合Aβ多肽抗原,經(jīng)鼻粘膜分別免疫轉(zhuǎn)基因癡呆模型鼠(J20),探討它們對Aβ多肽抗原效應(yīng)的增強(qiáng)作用,增強(qiáng)的抗體效應(yīng)是否能在小鼠體內(nèi)發(fā)揮有效的生物學(xué)效應(yīng),包括：減少小鼠腦中Aβ的含量,抑制腦中Aβ纖維斑塊的形成,改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；檢測免疫后小鼠腦中Th1, Th2反應(yīng)及乙酰膽堿酯酶(AChE)的含量；同時進(jìn)行CB、AL二者之間的比較。 實(shí)驗(yàn)方法繁殖轉(zhuǎn)基因癡呆模型鼠,子代鼠用PCR法基因鑒定。選取轉(zhuǎn)基因陽性癡呆模型鼠24只,至7月齡時隨機(jī)分成4組：Aβ+CB組,Aβ+AL組,單Aβ組,陽性對照組,另設(shè)1組轉(zhuǎn)基因陰性對照組,每組6只。鼻腔滴入免疫小鼠,1次／周,持續(xù)5個月,采用間接ELISA法檢測小鼠的血清抗體效價(jià)。免疫結(jié)束后,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后,脫頸法處死小鼠,取小鼠左半側(cè)腦組織制備腦勻漿上清液,雙抗夾心ELISA法檢測腦中Aβ的含量；取小鼠右半側(cè)腦組織固定,免疫組織化學(xué)染色觀察腦中Aβ斑塊的形態(tài)。另外,ELISA試劑盒檢測上述的腦勻漿上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10細(xì)胞因子濃度及AchE含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫5個月后,Aβ+CB組抗體效價(jià)最高(1：4000),其次為Aβ+AL組(1：2000),而未加佐劑的單Aβ組最低(1：500)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),與陽性對照組比較,Aβ+CB組尋找隱性平臺時間縮短了50%左右(P0.05),Aβ+AL組尋找隱性平臺時間雖縮短了20%-40%,但標(biāo)準(zhǔn)差大,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無顯著性(P0.05),而單Aβ組尋找隱性平臺時間沒有明顯縮短(P0.05)。腦中Aβ的相對含量檢測結(jié)果,與陽性對照組腦中A β的相對含量(1.012±0.323)相比,Aβ+CB組腦中A β的相對含量(0.383±0.156)明顯減少(P0.05),Aβ+AL組A β的相對含量(0.728±0.249)略有降低,而單Aβ組Aβ相對含量(1.016±0.301),數(shù)值上與陽性對照組很接近。免疫組織化學(xué)觀察,陽性對照組,海馬區(qū),齒狀回周圍以彌散的非神經(jīng)突斑為主,與其他組海馬區(qū)比較,AD斑塊量最多；大腦皮質(zhì)區(qū),腦中Aβ斑塊以彌散性的神經(jīng)突斑,彌散性的非神經(jīng)突斑為主,與其他組的大腦皮質(zhì)區(qū)比較,Aβ斑塊量最多。與陽性對照組比較,Aβ+CB組,海馬區(qū),齒狀回周圍同樣以彌散的非神經(jīng)突斑為主,Aβ斑塊量減少了56.4%(P0.05)；大腦皮質(zhì)區(qū)以彌散的非神經(jīng)突斑為主,斑塊較小,Aβ斑塊量減少了45.6%(P0.05)。Aβ+AL組海馬區(qū)所見的Aβ斑塊形態(tài)與陽性對照組類似,Aβ斑塊量雖減少了30%左右,但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性(P0.05)；大腦皮質(zhì)區(qū)所見的Aβ斑塊形態(tài)與陽性對照組類似,Aβ斑塊量未見明顯減少(P0.05)。免疫5個月后,實(shí)驗(yàn)各組腦中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10細(xì)胞因子濃度,腦中乙酰膽堿酯酶(AchE)含量,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性(P0.05)。 結(jié)論使用CB佐劑增強(qiáng)了Ap的抗原效應(yīng),減少了癡呆鼠腦中Aβ的含量、抑制了腦中Aβ斑塊的形成,改善了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,而且使用CB佐劑的作用效果比AL更明顯。本研究結(jié)果為AD主動免疫的佐劑研究提供了一種新的選擇,具有潛在的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2370923