發(fā)布時(shí)間：2018-11-26 21:49

【摘要】：背景作為阿片類鎮(zhèn)痛藥,嗎啡在疼痛治療中應(yīng)用十分廣泛,但藥物濫用、誤用或長(zhǎng)期用藥引起的藥物依賴不容忽視。目前認(rèn)為,長(zhǎng)期反復(fù)應(yīng)用嗎啡可引起敏感神經(jīng)元發(fā)生可塑性變化,是阿片類藥物成癮的機(jī)制。小窩蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)在神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛,作為膜脂筏(Membrane lipid rafts,MLRs)絞手架蛋白,與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)。然而Cav-1在嗎啡所致的神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性改變中的作用尚缺乏深入研究。本研究探討了在嗎啡誘導(dǎo)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性改變過程中,Cav-1對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)標(biāo)志物生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(Growth association protein-43,GAP-43)和微管相關(guān)蛋白2(Microtube-associated protein-2,MAP-2)表達(dá)水平的影響。方法分離培養(yǎng)出生24 h內(nèi)的C57/BL/6小鼠皮層神經(jīng)元。首先建立慢性嗎啡暴露濃度梯度模型,于培養(yǎng)第7天將神經(jīng)元分為4組,對(duì)照組(Control)給予等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS),其它3組為嗎啡組(Morphine),分別給予1.0、10.0、100.0μmol/L嗎啡處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,引起神經(jīng)元慢性嗎啡暴露,通過MTT方法檢測(cè)神經(jīng)元活性,通過免疫蛋白印記檢測(cè)Cav-1表達(dá)水平,明確嗎啡濃度對(duì)神經(jīng)元活性和Cav-1表達(dá)的影響。選取既對(duì)神經(jīng)元活性無影響又誘導(dǎo)Cav-1增加的嗎啡濃度10.0μmol/L進(jìn)一步研究,通過q RT-PCR方法探討嗎啡對(duì)神經(jīng)元Cav-1轉(zhuǎn)錄水平的影響,通過蛋白免疫印跡和免疫熒光檢測(cè)嗎啡對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(Growth associated protein-43,GAP-43)、微管相關(guān)蛋白2(Microtube-associated protein-2,MAP-2)等神經(jīng)可塑性標(biāo)志物改變情況,驗(yàn)證神經(jīng)突生長(zhǎng)。繼之,通過Cav-1敲減技術(shù),研究Cav-1在嗎啡誘導(dǎo)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性改變中的作用。將原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元分為3組:對(duì)照組(Control)不進(jìn)行特殊處理;無義序列組(sh RNASc組)轉(zhuǎn)染攜帶無義序列sh RNA的慢病毒,使復(fù)感染指數(shù)(Multiplicity of Infection,MOI)為1;Cav-1敲減組(sh RNACav1組轉(zhuǎn)染攜帶Cav-1 sh RNA的慢病毒(Lentish RNACav1),使MOI為1。7天后將上述每組再次各分為2個(gè)亞組,分別給予等體積PBS或10.0μmol/L嗎啡,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。通過免疫蛋白印跡檢測(cè)Cav-1、GAP-43等目的蛋白,通過免疫熒光激光共聚焦和高內(nèi)涵分析系統(tǒng)對(duì)Cav-1和微管相關(guān)蛋白-2(Microtube associated protein-2,MAP-2)表達(dá)及神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度等形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果1)MTT分析表明,10μmol/L嗎啡對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活性無影響,同時(shí)蛋白免疫印跡表明該濃度嗎啡可誘導(dǎo)Cav-1水平升高。2)q RT-PCR結(jié)果顯示10μmol/L嗎啡可引起Cav-1 m RNA水平升高,在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)Cav-1表達(dá)。蛋白免疫印跡和免疫熒光表明嗎啡可引起GAP-43水平升高及MAP-2為標(biāo)記的神經(jīng)突生長(zhǎng)。3)通過慢病毒介導(dǎo)的Cav-1敲減,可抑制嗎啡所致的GAP-43表達(dá)增加及MAP-2標(biāo)記的神經(jīng)突延長(zhǎng)。結(jié)論嗎啡可引起小鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性改變,Cav-1在該過程中發(fā)揮重要作用。抑制Cav-1表達(dá),可減少嗎啡引起的神經(jīng)生長(zhǎng)標(biāo)志物GAP-43和MAP-2的增加,神經(jīng)生長(zhǎng)受抑。提示Cav-1可能是干預(yù)嗎啡成癮的潛在分子靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R749.61

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本文編號(hào)：2359710