【摘要】：研究目的:自閉癥(autism spectrum disorders,ASD)是一種具有高遺傳性、臨床異質(zhì)性和生物復(fù)雜性的神經(jīng)行為障礙類疾病。目前各獨(dú)立研究之間缺乏一個(gè)明確的共識(shí)。為此,我們進(jìn)行了不同來源的腦組織基因表達(dá)譜的meta分析,并建立了可視化數(shù)據(jù)庫來共享分析結(jié)果。此外,從建立的可視化數(shù)據(jù)庫中對(duì)所挑選的感興趣候選基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為進(jìn)一步探索自閉癥可能的有關(guān)發(fā)病機(jī)制及其防治提供新思路。研究方法:(1)可視化數(shù)據(jù)庫建立:本研究對(duì)目前所報(bào)道人源性ASD研究中的腦組織基因表達(dá)譜(84個(gè)男性大腦皮層尸體解剖樣本:病例35個(gè),對(duì)照49個(gè);18個(gè)女性大腦皮層尸體解剖樣本:病例12個(gè),對(duì)照6個(gè);32個(gè)小腦尸體解剖樣本:病例13個(gè),對(duì)照19個(gè);4個(gè)福爾馬林固定樣本:病例1個(gè),對(duì)照3個(gè))和鼠源性ASD模型的腦基因表達(dá)譜(80個(gè)樣本:ASD模型54個(gè),對(duì)照26個(gè))進(jìn)行meta分析。隨后采用R軟件編程,建立交互共享的ASD腦組織基因差異表達(dá)meta分析的可視化數(shù)據(jù)庫(database with meta-analysis of differentially expressed genes in Autism Spectrum Disorder,db MDEGA)。(2)候選基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證:首先從meta分析的可視化數(shù)據(jù)庫中選擇P≤10-5,然后通過文獻(xiàn)再篩選可能與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)的基因?yàn)楦信d趣的候選基因,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究利用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)誘導(dǎo)PC12神經(jīng)細(xì)胞突起過生長(zhǎng)作為ASD模型,并在此細(xì)胞模型上進(jìn)行候選基因驗(yàn)證。PC12細(xì)胞置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),經(jīng)過50 ng/ml NGF處理,0 ng/ml NGF作為對(duì)照,分別在24h、48h、72h、96h和118h時(shí)間點(diǎn),使用鬼比環(huán)肽染料進(jìn)行細(xì)胞骨架F-actin染色,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞突起形態(tài)變化,使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-PCR,RT-PCR)檢測(cè)候選基因表達(dá)水平。研究結(jié)果:(1)ASD基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)meta分析的可視化數(shù)據(jù)庫建立:在目前已報(bào)道的自閉癥腦組織基因芯片數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上,通過R語言軟件編程,進(jìn)行meta分析后,進(jìn)一步成功建立了備有注釋的自閉癥腦組織差異表達(dá)基因meta分析結(jié)果的數(shù)據(jù)庫db MDEGA,該數(shù)據(jù)庫具有公開門戶網(wǎng)站(https://dbmdega.shinyapps.io/db MDEGA/),可被研究者網(wǎng)絡(luò)可視化使用。在本研究建立的數(shù)據(jù)庫db MDEGA所呈現(xiàn)用戶界面中,顯示了不同性別、腦組織狀態(tài)以及腦組織區(qū)域的差異表達(dá)基因的meta分析統(tǒng)計(jì)值以及森林圖和豆形圖。該數(shù)據(jù)庫db MDEGA能夠提供可查詢的基于已報(bào)道過,并可以更新的自閉癥腦組織基因表達(dá)譜得到的meta分析結(jié)果,有助于發(fā)現(xiàn)自閉癥潛在的候選基因(本研究結(jié)果已投稿under review)。(2)突起過生長(zhǎng)的ASD細(xì)胞模型建立:利用不同時(shí)間和濃度的NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞突起過生長(zhǎng)。F-actin染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,50 ng/ml NGF處理可以引起PC12細(xì)胞平均突起數(shù)目和突起長(zhǎng)度增加,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。此外,NGF處理后的細(xì)胞平均突起數(shù)目和突起長(zhǎng)度也會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加(P0.05)。結(jié)果提示突起過生長(zhǎng)的ASD細(xì)胞模型建立成功。(3)突起過生長(zhǎng)的ASD細(xì)胞模型中候選基因水平改變:從meta分析可視化數(shù)據(jù)庫中篩選出可能與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)的候選基因包括regulator of G-protein signaling 2(RGS2)、transmembrane protein 132A(TMEM132A)、THO complex 5(THOC5)及Dna J heat shock protein family(Hsp40)member B1(DNAJB1)基因。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,RGS2基因在50 ng/ml NGF處理96h和118h后表達(dá)水平上調(diào)(P0.05)。TMEM132A基因在50 ng/ml NGF處理96h和118h后表達(dá)水平也出現(xiàn)上調(diào)(P0.05),且TMEM132A基因表達(dá)水平隨著處理時(shí)間增加出現(xiàn)增加趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。而DNAJB1和THOC5基因在不同處理組之間未發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平差異(P0.05)。研究結(jié)論:(1)首次成功建立了一個(gè)可供研究者查詢的meta分析結(jié)果可視化數(shù)據(jù)庫db MDEGA,為ASD病因的探索和機(jī)制的研究提供有價(jià)值的幫助。同時(shí),為其他疾病建立meta分析結(jié)果可視化數(shù)據(jù)庫提供了方法參見。(2)成功建立了突起過生長(zhǎng)的ASD細(xì)胞模型。(3)對(duì)通過可視化數(shù)據(jù)庫db MDEGA,挑選的RGS2、TMEM132A、DNAJB1和THOC5四個(gè)候選基因,在突起過生長(zhǎng)的ASD細(xì)胞模型上進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)其中的RGS2和TMEM132A基因在細(xì)胞模型上出現(xiàn)高表達(dá),這為后期研究RGS2和TMEM132A基因與自閉癥病因的關(guān)系提供重要的依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R749

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2345774