【摘要】：第一部分:FGF2調(diào)控星形膠質(zhì)細胞GLAST在PTSD治療中的作用及機制研究目的:FGF2是一種重要的具有神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞活化作用的有絲分裂原。以往研究報道FGF2可以改善SPS后星形膠質(zhì)細胞的失活,但是其作用的分子機制尚不明確。GLAST/GLT-1是與認(rèn)知相關(guān)的表達在星形膠質(zhì)細胞表面的重要谷氨酸轉(zhuǎn)運體,參與調(diào)節(jié)細胞外谷氨酸濃度和神經(jīng)元存活。本實驗旨在探討FGF2調(diào)控星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLAST和GLT-1、改善SPS模擬的PTSD樣行為的作用及機制。研究方法:成年雄性SD大鼠(250-300g,8周齡)70只隨機分為對照組(n=15),SPS(n=25),SPS+FGF2(n=15)以及SPS+FGF2+AG490(JAK/STAT抑制劑,n=15)組,SPS、經(jīng)腹腔給予FGF2(20 mg/kg·day)和AG490(10 mg/kg·day)處理。SPS后第7天至第28天行恐懼行為測試,第7/14/28天行曠場和高架十字迷宮實驗。行為學(xué)實驗結(jié)束后取材進行高效液相色譜、免疫熒光染色和Western blot實驗,檢測腦脊液谷氨酸濃度、海馬GFAP、GLT-1、GLAST、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3及STAT3含量。離體海馬星形膠質(zhì)細胞給予FGF2(30 ng/m L)和AG490(50μM)處理48 h,Western blot和免疫熒光染色研究蛋白表達情況。研究結(jié)果:SPS組的大鼠在SPS7天和14天后與對照組相比,在環(huán)境恐懼記憶及條件恐懼記憶中的不動時間均顯著延長(與對照組相比,P0.01)。在SPS14天后,SPS+FGF2組大鼠的條件恐懼及環(huán)境恐懼記憶不動時間均比SPS-14 day組顯著縮短(P0.01)。該治療效應(yīng)被AG490阻斷(與SPS+FGF2組相比,P0.05)。在曠場實驗和高架十字迷宮實驗中,FGF2顯著改善了SPS大鼠誘導(dǎo)的焦慮樣行為,具體表現(xiàn)為與對照組相比,SPS-7 day和-14day組大鼠曠場中央?yún)^(qū)運動距離和滯留時間縮短(P0.01),與SPS組相比,SPS+FGF2組大鼠的上述兩指標(biāo)延長(P0.01),與SPS+FGF2組相比,SPS+FGF2+AG490組曠場中央?yún)^(qū)運動距離(P0.05)和滯留時間(P0.01)均明顯縮短;在高架十字迷宮中,與對照組相比,SPS大鼠開臂滯留時間百分比和進入次數(shù)百分比均減少(P0.01),與SPS組相比,SPS+FGF2組兩項指標(biāo)增加(P0.01),與SPS+FGF2組相比,SPS+FGF2+AG490組兩項指標(biāo)均明顯縮短(P0.05)。HPLC實驗和Western blot,免疫熒光染色分別用于檢測腦脊液中谷氨酸的含量及海馬谷氨酸轉(zhuǎn)運體、JAK/STAT信號蛋白的表達。與對照組相比,SPS組大鼠腦脊液中谷氨酸濃度升高(P0.01),海馬GFAP、GLAST及GLT-1表達降低(P0.01),同時p-JAK1、p-JAK2、及p-STAT3表達降低(P0.01);與SPS組相比,SPS+FGF2組腦脊液谷氨酸含量降低(P0.01),海馬GFAP表達升高(P0.01),GLAST上調(diào)(P0.01),GLT-1表達增加(P0.05),同時p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3表達升高(P0.01);AG490逆轉(zhuǎn)了FGF2的分子生物學(xué)效應(yīng),與SPS+FGF2組相比,SPS+FGF2+AG490組腦脊液谷氨酸再次升高(P0.05),海馬GFAP、GLAST、p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3均降低(P0.05)。FGF2處理離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞GFAP、GLAST、GLT-1、p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3表達增加(與對照組相比,P0.05),AG490處理離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞上述分子表達減少(與對照組相比,P0.05),同時給予FGF2和AG490,星形膠質(zhì)細胞上述分子表達不變。研究結(jié)論:本實驗發(fā)現(xiàn)SPS會抑制星形膠質(zhì)細胞的JAK/STAT通路活性,從而抑制星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體,進而引起谷氨酸穩(wěn)態(tài)失衡,擾亂中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性-抑制性神經(jīng)傳遞的平衡,進而引起PTSD樣癥狀;相反,FGF2通過激活星形膠質(zhì)細胞JAK/STAT信號通路發(fā)揮治療PTSD的作用。第二部分:Trk/ERK/CREB介導(dǎo)的神經(jīng)元突觸可塑性與NGF治療PTSD作用機制研究研究目的:NGF是臨床上廣泛使用的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,研究表明,PTSD患者存在NGF表達的異常。神經(jīng)可塑性改變構(gòu)成應(yīng)激相關(guān)障礙共同的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。本實驗在之前實驗的基礎(chǔ)上建立小鼠SPS動物模型,旨在研究NGF能否影響SPS誘導(dǎo)的PTSD樣行為,改善SPS誘導(dǎo)的神經(jīng)突觸可塑性改變,及其潛在的分子機制:是否依賴于ERK/CREB信號通路的激活。研究方法:實驗一:75只成年雄性C57小鼠隨機分為對照組,SPS-3 day,SPS-7 day,SPS-14 day,SPS-28 day組(每組15只),檢測p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synaptophysin在不同靜止期過后的表達。實驗二:105只成年雄性C57小鼠隨機分為對照組,SPS組以及SPS+0.3,SPS+1.0,SPS+3.0,SPS+10.0以及SPS+30.0(μg/kg·day NGF)劑量組(每組15只)。各組檢測環(huán)境恐懼和條件恐懼不動時間,采用Western blot技術(shù)檢測海馬p-CREB的表達。實驗三:60只成年雄性C57小鼠隨機分為對照組,SPS-14 day組,SPS-14 day+生理鹽水組,以及SPS-14 day+NGF(10μg/kg·day)組(每組15只),檢測動物行為學(xué)、形態(tài)學(xué)改變以及p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synap等蛋白的表達情況。實驗四:離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元給予NGF(50 ng/m L)和PD98059(MEK1抑制劑,20μM)處理48 h,觀察神經(jīng)元形態(tài)和分子生物學(xué)改變。研究結(jié)果:與對照組相比,SPS誘導(dǎo)小鼠環(huán)境恐懼記憶和條件恐懼記憶實驗不動時間延長(P0.01),NGF劑量依賴性地縮短恐懼記憶不動時間,其減輕環(huán)境恐懼記憶和條件恐懼記憶的半數(shù)有效劑量(effective dose 50%)分別為1.935μg/kg·day和1.873μg/kg·day。本實驗參照臨床上NGF的用藥劑量、NGF處理SPS小鼠的劑量-效應(yīng)曲線以及ED50,滴定NGF濃度為3.0μg/kg·day。3.0μg/kg·day NGF處理能夠改善SPS誘導(dǎo)的焦慮樣行為:在EPMT中,與對照組相比,SPS組的開臂進入次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比減小,而閉臂進入次數(shù)百分比和閉臂滯留時間百分比增大(P0.01);與SPS組相比,SPS+NGF組的開臂進入次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比增加(P0.01),閉臂進入次數(shù)百分比(P0.05)和閉臂滯留時間百分比減小(P0.01);在OFT,SPS組的中央?yún)^(qū)運動距離和滯留時間減少(與對照組相比,P0.01);與SPS組相比,SPS+NGF組的中央?yún)^(qū)運動距離和滯留時間增加(P0.05);對照組、SPS組和SPS+NGF組的總運動距離和速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示SPS和NGF對小鼠的運動功能無影響。Golgi染色結(jié)果顯示,與對照組相比,SPS組小鼠海馬神經(jīng)元基樹突和頂樹突總長度縮短(P0.01),基樹突和頂樹突突起數(shù)目及分枝數(shù)目減少(P0.05),同時樹突棘密度減少(P0.01);NGF逆轉(zhuǎn)了SPS誘導(dǎo)的突觸可塑性改變,與SPS組相比,SPS+NGF組小鼠海馬神經(jīng)元基樹突和頂樹突總長度延長(P0.05),基樹突和頂樹突突起數(shù)目及分枝數(shù)目增加(P0.05),同時樹突棘密度增加(P0.01)。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,SPS組的海馬p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synaptophysin隨著靜止期的延長不斷減少,在SPS-14 day降至最低水平(P0.05),選取14天為SPS后靜止期,給予NGF處理后,上述蛋白表達恢復(fù)如常(與SPS組相比,P0.05)。離體實驗進一步揭示了NGF對于神經(jīng)可塑性和突觸相關(guān)蛋白影響以及可能的分子機制:與對照組相比,NGF組的樹突分枝數(shù)目及總長度顯著增加(P0.01),PD98059組的樹突分枝數(shù)目及總長度減少(P0.05);與PD98059組相比,NGF+PD98059組上述兩項指標(biāo)增加至正常水平(P0.05),說明NGF通過逆轉(zhuǎn)PD98059對海馬神經(jīng)元ERK通路的抑制作用改善突觸可塑性;與對照組相比,NGF組p-Trk,p-ERK,p-CREB,MAP2表達增加(P0.05),PD98059降低了海馬神經(jīng)元ERK和CREB的磷酸化水平及MAP2表達(與對照組相比,P0.05),該效應(yīng)被NGF逆轉(zhuǎn)(與PD98059組相比,P0.05)。研究結(jié)論:NGF通過激活海馬ERK/CREB信號通路改善SPS誘導(dǎo)的突觸可塑性損害,減輕PTSD樣行為學(xué)改變。第三部分:PTEN/Akt通路介導(dǎo)的ACC神經(jīng)元突觸可塑性增強與r TMS治療PTSD機制相關(guān)性研究研究目的:r TMS是一種新型的物理治療手段,臨床上正逐步推廣用于精神疾病的治療。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),r TMS有效緩解大鼠SPS處理誘導(dǎo)的PTSD動物模型的焦慮樣行為,但是r TMS是否對其恐懼行為具有緩解作用以及r TMS治療PTSD深層次的分子機制尚未探明。本實驗立足于現(xiàn)有發(fā)現(xiàn),結(jié)合臨床影像學(xué)研究結(jié)果,觀察了r TMS對SPS模型前扣帶回(ACC)谷氨酸能神經(jīng)傳遞及突觸可塑性的影響,以及介導(dǎo)r TMS作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。研究方法:本實驗首先研究了不同靜止期(7day/14day)、高頻r TMS(Hr TMS,15Hz)和低頻r TMS(Lr TMS,1Hz)對SPS大鼠ACC谷氨酸受體表達的影響,60只成年雄性SD大鼠(250-300g,8周齡)隨機分為對照組(r TMS假刺激,sham,n=12),SPS-7d組(n=12),SPS-14d組(n=12),SPS+Hr TMS(n=12)以及SPS+Lr TMS組(n=12),由于檢測14 day靜止期對谷氨酸受體表達影響最為顯著,SPS處理7天靜止期后給予r TMS連續(xù)處理7天(每天1次)。48只SD大鼠隨機分為對照組、si PTEN組、bp V組、wortmannin組(每組12只),檢測ACC區(qū)域PTEN和p-Akt表達。為了檢測Hr TMS是否通過PTEN/Akt信號通路改善SPS處理后ACC谷氨酸受體表達、突觸可塑性及行為學(xué)改變,96只SD大鼠隨機分為sham(n=16),SPS(n=16),SPS+Hr TMS(n=16),SPS+Hr TMS+bp V(n=16),SPS+Hr TMS+si PTEN(n=16)及SPS+Hr TMS+wortmannin(Akt抑制劑,n=16)組。r TMS干預(yù)結(jié)束后進行OFT,EPMT,恐懼箱實驗(fear conditioning test,FCT)以及前脈沖抑制實驗(prepulse inhibition,PPI)。采用Western blot實驗檢測各組谷氨酸受體、PTEN、p-Akt、Akt等分子的表達;采用免疫熒光染色雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記檢測ACC神經(jīng)元中NR2B、Glu R1及p-Akt表達。采用Golgi染色技術(shù)研究各組神經(jīng)元突觸可塑性的改變。研究結(jié)果:Western blot實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,SPS-7d組、SPS-14d組SPS+Lr TMS組和SPS+Hr TMS組ACC中NR1、NR2A、NR2B、Glu R1、Glu R2、Glu R3及Glu R4表達降低(P0.05),與SPS-14d組相比,SPS+Hr TMS組上述分子表達增加(P0.01)。與對照組相比,SPS-7d組和SPS-14d組ACC區(qū)PTEN表達增加,p-Akt表達減少(P0.01),Hr TMS而非Lr TMS逆轉(zhuǎn)了上述改變:與SPS-14d組相比,SPS+Hr TMS組PTEN表達減少,p-Akt表達增加(P0.05)。免疫熒光染色實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,其他4組ACC中Glu R1及NR2B表達降低(P0.05),與SPS-14d組相比,SPS+Hr TMS組Glu R1及NR2B表達增加(P0.05)。Neu N染色進一步證實,受SPS和Hr TMS調(diào)控的p-Akt位于神經(jīng)元中。定位注射給予bp V、si PTEN及wortmannin后,大鼠ACC區(qū)域神經(jīng)元PTEN、p-Akt有相應(yīng)的改變:與對照組相比,si PTEN組PTEN表達降低(P0.01),bp V和si PTEN組p-Akt升高(P0.01),wortmannin組p-Akt降低(P0.01)。在SPS、Hr TMS基礎(chǔ)上給予bp V、si PTEN及wortmannin處理發(fā)現(xiàn),si PTEN和bp V增強了Hr TMS的效應(yīng),而wortmannin阻斷了Hr TMS的效應(yīng):與SPS+Hr TMS組相比,SPS+HTMS+si PTEN組和SPS+Hr TMS+bp V組p-Akt、NR2B、Glu R1表達增加(P0.05),SPS+Hr TMS+wortmannin組p-Akt、NR2B、Glu R1表達降低(P0.01)。Golgi染色顯示:與對照組相比,SPS組ACC神經(jīng)元樹突總長度、樹突分枝數(shù)目、樹突棘密度均減小(P0.01);與SPS組相比,SPS+Hr TMS組上述指標(biāo)增加(P0.05);與SPS+Hr TMS組相比,SPS+Hr TMS+bp V組樹突總長度、樹突分枝數(shù)目、樹突棘密度進一步增加(P0.05),SPS+Hr TMS+wortmannin組頂樹突樹突總長度、樹突分枝數(shù)目、頂樹突和基樹突樹突棘密度均減小(P0.05)。FCT顯示,與對照組相比,SPS組環(huán)境恐懼記憶及條件恐懼記憶實驗不動時間延長(P0.01),與SPS組相比,SPS+Hr TMS組不動時間縮短(P0.05),與SPS+Hr TMS組相比,SPS+Hr TMS+bp V組不動時間縮短(P0.05)SPS+Hr TMS+wortmannin組不動時間延長(P0.05)。EPMT中,與對照組相比,SPS組開臂進入次數(shù)和開臂滯留時間百分比減少(P0.01),與SPS組對比,SPS+Hr TMS組上述指標(biāo)增大(P0.05),與SPS+Hr TMS組對比,SPS+Hr TMS+bp V組開臂滯留時間百分比增大(P0.05),SPS+Hr TMS+wortmannin組開臂進入次數(shù)和開臂滯留時間百分比減少(P0.05)。OFT中,與對照組相比,SPS組中央?yún)^(qū)運動距離和滯留時間百分比減少(P0.01),與SPS組對比,SPS+Hr TMS組上述指標(biāo)增大(P0.05),與SPS+Hr TMS組對比,SPS+Hr TMS+bp V組中央?yún)^(qū)滯留時間百分比增大(P0.05),SPS+HrTMS+wortmannin組中央?yún)^(qū)運動距離和滯留時間百分比減少(P0.05)。PPI實驗中,與對照組相比,SPS組PPI指數(shù)減小(P0.01),與SPS組對比,SPS+Hr TMS組PPI指數(shù)增大(P0.05),與SPS+Hr TMS組對比,SPS+Hr TMS+bp V組PPI指數(shù)增大(P0.05),SPS+Hr TMS+wortmannin組PPI指數(shù)減小(P0.05)。研究結(jié)論:本實驗印證了先期工作證明的高頻r TMS對SPS大鼠焦慮樣行為的改善作用,同時發(fā)現(xiàn)高頻r TMS通過激活A(yù)CC神經(jīng)元PTEN/Akt信號通路增強谷氨酸能神經(jīng)傳遞和突觸可塑性,進而減輕SPS誘導(dǎo)的條件恐懼和環(huán)境恐懼記憶增強,改善PTSD樣行為學(xué)改變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R749.5
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本文編號：2335930