【摘要】：目的：淀粉樣前體蛋白（APP）經(jīng)過β-分泌酶和γ-分泌酶水解，釋放出Aβ肽。Aβ肽是淀粉斑的核心成分，它的過多生成或聚集被認(rèn)為是阿爾茨海默病致病的主要原因。APP蛋白還有另一條非淀粉樣蛋白加工途徑，在這條途徑中，它被α-分泌酶和γ-分泌酶連續(xù)水解。由于α-分泌酶的水解APP位點(diǎn)在Aβ肽內(nèi)部，因此，可以減少Aβ肽的生成。目前，已經(jīng)證實(shí)去整合素和金屬蛋白酶10（ADAM10）是神經(jīng)元的組成型APP α-分泌酶。但是，ADAM10缺失究竟對成年神經(jīng)細(xì)胞的功能造成何種影響迄今不清楚，為此，我們利用本室建立的成年大腦神經(jīng)細(xì)胞特異性ADAM10基因敲除小鼠（ADAM10cKO）模型研究ADAM10基因缺失對APP代謝水平和小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。 方法：利用PCR方法鑒定ADAM10cKO小鼠的基因型。鑒定出的純合子小鼠用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。按照常規(guī)的組織學(xué)方法，取3、6、9和12月齡ADAM10cKO小鼠和野生型C57BL/6J小鼠（WT）的大腦，經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片和HE染色，觀察ADAM10cKO小鼠和WT小鼠大腦海馬和皮層組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，以及皮層第5層和海馬神經(jīng)元數(shù)量的變化。分別取7、9、11、12、13和15月齡ADAM10cKO小鼠和ADAM10Fl/Fl對照小鼠的大腦，經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片和免疫組織化學(xué)染色，觀察β淀粉樣蛋白（Aβ）在大腦皮層和海馬組織中的分布，并分析Aβ沉積與年齡的關(guān)系。分別提取20月齡的ADAM10cKO小鼠和ADAM10Fl/Fl小鼠的皮層和海馬組織蛋白，采用Western blotting方法定量測定APP和Aβ肽的含量，分析ADAM10基因缺失對APP代謝的影響。分別取10月齡ADAM10cKO小鼠和WT小鼠各9只進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，通過檢測逃避潛伏期、目標(biāo)象限（原先放置平臺的象限）停留的時(shí)間百分比和1min內(nèi)穿過平臺次數(shù)評價(jià)兩組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。 結(jié)果：HE染色結(jié)果表明，3、6、9和12月齡ADAM10cKO小鼠大腦皮層和海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常，，但是，皮層第Ⅴ層的神經(jīng)元數(shù)量隨著年齡的增大而減少，海馬神經(jīng)細(xì)胞減少更為明顯。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7、9、11、13和15月齡ADAM10cKO小鼠與同齡的ADAM10Fl/Fl對照小鼠相比，其大腦皮層和海馬未見淀粉斑，但在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)可溶性Aβ肽呈年齡依賴性增加�？扇苄訟β肽的含量在兩種小鼠的海馬和皮層的神經(jīng)細(xì)胞中表現(xiàn)出差異。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADAM10cKO小鼠與ADAM10FL/FL小鼠比較，其成熟與非成熟的全長APP蛋白含量在海馬中分別減少73.0%和62.3%（P㩳0.01），但是，在大腦皮層中，成熟與非成熟的全長APP蛋白含量變化不明顯；ADAM10cKO小鼠大腦皮層和海馬中Aβ肽總含量分別增加20.45%和27.21%（P0.05和P0.01），皮層中Aβ1-38、 A β1-40和A β1-42肽的含量分別增加32.85%、25.37%和80.95%(P0.05，P0.05和P0.01)，海馬中Aβ1-38、Aβ1-40和Aβ1-42肽的含量分別增加41.67%、38.36%和22.22%（P㩳0.05），呈現(xiàn)明顯差異。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在訓(xùn)練期間，ADAM10cKO小鼠的平均潛伏期比WT小鼠的時(shí)間長，第2天和第3天分別表現(xiàn)出明顯差異（P㩳0.05和P㩳0.01）。在測試期間，ADAM10cKO小鼠和WT小鼠相比，其平均穿越平臺的次數(shù)少，并且，平均停留目標(biāo)象限時(shí)間的百分比低，均呈現(xiàn)明顯差異（P㩳0.05）。 結(jié)論：ADAM10基因缺失導(dǎo)致成年小鼠大腦皮層和海馬的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少。APP含量在大腦皮層中無變化，而在海馬中明顯減少，可能是海馬神經(jīng)元過多丟失所致�？扇苄訟β肽含量呈年齡依賴性增加，是神經(jīng)退化和認(rèn)知功能受到損害的主要原因。
[Abstract]:OBJECTIVE: Amyloid precursor protein (APP) is hydrolyzed by beta-secretase and gamma-secretase to release a beta peptide. A beta peptide is the core component of amyloid plaque. Its excessive production or aggregation is considered to be the main cause of Alzheimer's disease. APP protein also has another non-amyloid protein processing pathway, in which it is processed by alpha-secretase and gamma-secretase. Continuous hydrolysis of gamma-secretase. As the APP site of alpha-secretase is located within the A-beta peptide, the production of A-beta peptide can be reduced. At present, it has been confirmed that disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10) are constitutive APP-secretases of neurons. However, it is unclear how the deletion of ADAM10 affects the function of adult neurons. In order to investigate the effects of ADAM10 gene deletion on APP metabolism and learning and memory in adult brain neuron-specific ADAM10 knockout mice (ADAM10cKO), we established a model in our laboratory.
METHODS: The genotypes of ADAM10cKO mice were identified by PCR. The homozygous mice were used for follow-up study. According to conventional histological methods, the brains of ADAM10cKO mice and wild type C57BL/6J mice (WT) were taken and fixed, dehydrated, transparent, paraffin embedded, sliced and stained with HE. The brain of ADAM10cKO mice and A DAM10Fl/Fl control mice aged 7,9,11,12,13 and 15 months were fixed, dehydrated, transparent, paraffin embedded, sectioned and immunohistochemical stained to observe the changes of amyloid beta (Abeta) in the brain. The protein of cortex and hippocampus of ADAM10 cKO mice and ADAM10 Fl/Fl mice aged 20 months were extracted respectively. The content of APP and A beta peptide was quantitatively determined by Western blotting. The effect of ADAM10 gene deletion on APP metabolism was analyzed. The learning and memory abilities of the two groups were evaluated by detecting the escape latency, the percentage of time spent in the target quadrant (the quadrant where the platform was originally placed) and the number of times crossed the platform in one minute.
Results: The results of HE staining showed that the morphological structure of cerebral cortex and hippocampus of ADAM10cKO mice aged 3,6,9 and 12 months had no obvious abnormality, but the number of neurons in the fifth cortex decreased with the increase of age, and the decrease of neurons in hippocampus was more obvious. Compared with A DAM10Fl/Fl control mice of the same age, there was no amyloid plaque in cerebral cortex and hippocampus, but soluble A-beta peptide in neurons increased in an age-dependent manner. Compared with mice, the content of mature and immature full-length APP protein in hippocampus decreased by 73.0% and 62.3% (P? 0.01), but the content of mature and immature full-length APP protein did not change significantly in cerebral cortex; the total content of Abeta peptide in cerebral cortex and hippocampus of ADAM10cKO mice increased by 20.45% and 27.21% (P 0.05 and P 0.01), respectively, and Abeta 1-3 in cortex. The contents of 8, A-beta-1-40 and A-beta-42 peptides increased by 32.85%, 25.37% and 80.95% (P 0.05, P 0.05 and P 0.01), respectively. The contents of A-beta-38, A-beta-40 and A-beta-42 peptides in hippocampus increased by 41.67%, 38.36% and 22.22% (P?0.05), respectively. The results of water maze experiment showed that the average latency of ADAM-10 cKO mice was longer than that of WT mice. During the test period, ADAM 10cKO mice and WT mice crossed the platform fewer times on average, and the percentage of average dwell time in the target quadrant was lower (P?0.05).
CONCLUSION: The deletion of ADAM10 gene results in a significant decrease in the number of neurons in the cerebral cortex and hippocampus of adult mice. APP content has no change in the cerebral cortex, but decreased significantly in the hippocampus, possibly due to excessive loss of neurons in the hippocampus. Main cause.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

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本文編號：2177254