本文關(guān)鍵詞：慢性應(yīng)激性抑郁發(fā)生與海馬Glu和GABA水平變化及其受體機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2010年

產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及作為酸奶發(fā)酵劑條件的研究

劉寧寧  

【摘要】： γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一種廣泛分布于自然界的非蛋白質(zhì)氨基酸。在生物體內(nèi)由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)催化轉(zhuǎn)化而來,是目前研究較深入的一種重要抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì),參與體內(nèi)多種代謝活動(dòng),具有很多的生理功能,如降血壓、改善腦功能、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)長期記憶及肝、腎機(jī)能等功能。含有谷氨酸脫羧酶的乳酸菌也能將谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA,是GABA產(chǎn)生的一個(gè)重要途徑,本研究的主要目的是選育高產(chǎn)GABA的乳酸菌菌株,研究該菌株應(yīng)用于酸奶的可行性,并利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法確定這種酸奶的降血壓作用。 谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)是生物體內(nèi)催化谷氨酸或其鈉鹽脫羧生成GABA的唯一酶。本研究通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)對(duì)供試的64株乳酸菌基因組片段進(jìn)行擴(kuò)增,檢測是否含有g(shù)ad基因,同時(shí)采用高效液相色譜方法測定菌株GABA的生成量,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)結(jié)果具有對(duì)應(yīng)關(guān)系,即含有g(shù)ad基因的乳酸菌能代謝產(chǎn)生GABA,不產(chǎn)GABA的乳酸菌也沒有g(shù)ad基因陽性擴(kuò)增。 從64株乳酸菌中篩選出1株高產(chǎn)GABA的短乳桿菌KLDS1.0727,該菌株的GABA產(chǎn)量為1.98g/L。對(duì)該菌株進(jìn)行紫外誘變處理,獲得突變菌株1.0727-19,其GABA產(chǎn)量為3.01g/L。對(duì)該突變株再進(jìn)行亞硝基胍誘變處理,獲得一株遺產(chǎn)穩(wěn)定的高產(chǎn)GABA的突變菌株1.0727-19-1,GABA產(chǎn)量達(dá)5.04g/L。 對(duì)短乳桿菌1.0727-19-1的GAD的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,包括酶的熱穩(wěn)定性、反應(yīng)最適溫度和最適pH,以及一些金屬離子和磷酸吡哆醛對(duì)酶活力的影響。結(jié)果表明:此酶最適溫度為37℃,耐熱性較差,最適pH為4.3,對(duì)底物的Km為57.17 mmol/L,金屬離子對(duì)酶活力有較大影響,其中Ca~(2+)、Cu~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)對(duì)酶活力有促進(jìn)作用,K~+、Fe~(2+)有抑制作用,磷酸吡哆醛在低濃度時(shí)有一定激活作用,當(dāng)濃度達(dá)到30μmol/L時(shí),隨濃度提高反而有抑制作用。確定添加突變菌株1.0727-19-1生產(chǎn)酸奶的最佳發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度為42℃,突變菌株的接種量為106CFU/mL,谷氨酸的添加量為1.5g/L。 采用原發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)和Wistar大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),研究添加突變菌株1.0727-19-1的酸奶的作用,發(fā)現(xiàn):SHR在灌胃后的6～8h,收縮壓達(dá)到最低,與對(duì)照組相比顯著降低(P0.05),隨突變菌株1.0727-19-1添加量的增加,降壓效果越明顯,連續(xù)灌胃4周后高劑量組SHR血壓降低了22.7mmHg,差異顯著(P0.05),而Wistar大鼠血壓下降不明顯(P0.05),說明該酸奶對(duì)正常大鼠的血壓沒有明顯影響。高劑量組SHR心臟血液中ACE活性顯著降低,表明抑制ACE活性是GABA降血壓機(jī)理之一。 本研究得到如下結(jié)論:發(fā)現(xiàn)含有g(shù)ad基因的乳酸菌能夠產(chǎn)生GABA,而不產(chǎn)GABA的菌株也沒有出現(xiàn)gad基因的陽性擴(kuò)增,具有對(duì)應(yīng)性。通過誘變育種得到一株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)GABA突變菌株1.0727-19-1,其GABA產(chǎn)量達(dá)5.04mg/L;確定了添加該菌株酸奶的發(fā)酵條件,高血壓大鼠試驗(yàn)表明:該酸奶具有一定降血壓功能,本研究對(duì)研制和開發(fā)富含GABA的功能性乳制品具有一定指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：TS252.54
【目錄】：

中文摘要8-10

英文摘要10-12

1 前言12-24

1.1 立題背景12-13

1.2 γ-氨基丁酸綜述13-17

1.2.1 γ-氨基丁酸簡介13

1.2.2 γ-氨基丁酸的主要生理功能13-15

1.2.3 γ-氨基丁酸的制備方法15-16

1.2.4 γ-氨基丁酸的檢測方法16-17

1.3 微生物菌株誘變育種的常見方法17-19

1.4 乳酸菌谷氨酸脫羧酶的研究進(jìn)展19-21

1.4.1 谷氨酸脫羧酶在乳酸菌合成γ-氨基丁酸中的作用19-20

1.4.2 乳酸菌谷氨酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)20-21

1.5 富含γ-氨基丁酸食品的降血壓作用21

1.6 本研究的目的與意義21-23

1.7 本研究擬采取的技術(shù)路線23-24

2 材料與方法24-38

2.1 試驗(yàn)材料24-26

2.1.1 供試菌株24-25

2.1.2 培養(yǎng)基25

2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25-26

2.1.4 主要試劑及來源26

2.2 儀器與設(shè)備26-27

2.3 試驗(yàn)方法27-38

2.3.1 乳酸菌谷氨酸脫羧酶與其產(chǎn)γ-氨基丁酸相關(guān)性的研究27-30

2.3.2 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的誘變育種30-31

2.3.3 高產(chǎn)γ-氨基丁酸突變菌株的谷氨酸脫羧酶性質(zhì)的研究31-33

2.3.4 添加高產(chǎn)γ-氨基丁酸突變菌株酸奶最佳發(fā)酵條件的確定33-35

2.3.5 添加高產(chǎn)γ-氨基丁酸突變菌株酸奶的動(dòng)物試驗(yàn)35-38

3 結(jié)果與分析38-56

3.1 乳酸菌谷氨酸脫羧酶與其產(chǎn)γ-氨基丁酸的相關(guān)性38-41

3.1.1 乳酸菌 DNA 的提取與濃度的測定38

3.1.2 PCR 方法檢測乳酸菌中的谷氨酸脫羧酶基因38-39

3.1.3 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立39-41

3.2 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的誘變育種41-45

3.2.1 紫外誘變41-43

3.2.2 亞硝基胍誘變43-45

3.3 高產(chǎn)γ-氨基丁酸突變菌株谷氨酸脫羧酶性質(zhì)的研究45-49

3.3.1 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性45-46

3.3.2 酶反應(yīng)最適 pH46-47

3.3.3 反應(yīng)產(chǎn)物的生成與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系47

3.3.4 底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響47-48

3.3.5 金屬離子對(duì)酶活力的影響48

3.3.6 磷酸吡哆醛對(duì)酶活力的影響48-49

3.4 添加高產(chǎn)γ-氨基丁酸突變菌株酸奶最佳發(fā)酵條件的確定49-53

3.4.1 最佳發(fā)酵溫度的確定49-50

3.4.2 最佳接種量的確定50-51

3.4.3 谷氨酸最佳添加量的確定51-53

3.5 添加高產(chǎn)γ-氨基丁酸突變菌株酸奶的動(dòng)物試驗(yàn)53-56

3.5.1 γ-氨基丁酸對(duì)大鼠尾部動(dòng)脈血壓的影響53-54

3.5.2 γ-氨基丁酸對(duì)組織內(nèi)源性血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的影響54-56

4 討論56-59

4.1 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選56

4.2 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的的誘變育種56-57

4.3 乳酸菌谷氨酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)的研究57-58

4.4 富含γ-氨基丁酸酸奶的降血壓作用58-59

5 結(jié)論59-60

致謝60-61

參考文獻(xiàn)61-65

攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65

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2 本期主講人:江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授 江波;[N];中國食品報(bào);2009年

3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 韋習(xí)會(huì) 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 趙茹茜 陳杰;[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2009年

4 中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)乳酸菌分會(huì);[N];中國食品報(bào);2011年

5 苗君蒞 陳有容 齊鳳蘭 郭本恒;[N];中國食品報(bào);2011年

6 曹麗君;[N];新華每日電訊;2005年

7 吳綿;[N];中國質(zhì)量報(bào);2007年

8 主講人:江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授 江波;[N];中國食品報(bào);2009年

9 嘉興釀造總公司 汪建國;[N];華夏酒報(bào);2010年

10 實(shí)習(xí)記者 何慧;[N];四川日報(bào);2010年

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