本文選題：EPAC2 + Tau磷酸化　； 參考：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：[背景] 阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)是一種常見的、進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病,其主要病理學(xué)特征是腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)和細(xì)胞外的老年斑(SPs)的形成。NFTs的主要成分是過度磷酸化的Tau。異常磷酸化的Tau喪失促微管組裝和穩(wěn)定微管的功能,并聚集成為成對(duì)螺旋絲(PHF),最終導(dǎo)致NFTs的形成、突觸的退變和神經(jīng)元的丟失,在AD的病程發(fā)生、發(fā)展中起了關(guān)鍵作用。 鳥嘌呤核苷酸交換蛋白(EPAC)作為cAMP直接激活的下游蛋白,在生物進(jìn)程調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。EPAC1/2敲除小鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶和社會(huì)交往的障礙,且EPAC2亞型在AD患者腦中]nRNA水平表達(dá)下降,提示EPAC2下調(diào)參與AD的病程調(diào)節(jié)。然而EPAC2信號(hào)如何調(diào)節(jié)體內(nèi)相關(guān)通路,從而影響學(xué)習(xí)記憶尚不清楚。 [目的] 探討EPAC2調(diào)節(jié)的信號(hào)通路對(duì)Tau蛋白異常過度磷酸化的調(diào)控機(jī)制；探究如何逆轉(zhuǎn)EPAC2下調(diào)后帶來的學(xué)習(xí)記憶障礙。 [方法] 在探討EPAC2信號(hào)通路對(duì)Tau蛋白異常過度磷酸化調(diào)控機(jī)制的研究中,我們應(yīng)用了EPAC2-/-轉(zhuǎn)基因小鼠和si-EPAC2質(zhì)粒,應(yīng)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)在整體水平和細(xì)胞水平分別檢測(cè)Tau蛋白磷酸化相關(guān)抗體的表達(dá),并分離出可溶性和不可溶蛋白組分對(duì)Tau蛋白的溶解性進(jìn)行探討。為了驗(yàn)證是否有Tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié),我們進(jìn)行了Bielschowsky銀染。 為了探究造成上述結(jié)果的機(jī)制,我們應(yīng)用免疫印跡反應(yīng)篩選了一系列與Tau蛋白磷酸化相關(guān)的激酶酯酶,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化關(guān)鍵的激酶CDK5被激活,再根據(jù)文獻(xiàn)研究找到CDK5上游因子Calpain并進(jìn)行活性檢測(cè)。為了解釋EPAC2下調(diào)與Calpain的關(guān)聯(lián)性,應(yīng)用ELISA從多個(gè)免疫因子中最終篩選出TGFβ1這個(gè)EPAC2和Calpain的中間連接因子。 為了逆轉(zhuǎn)EPAC2下調(diào)帶來的Tau病變,我們應(yīng)用了Calpain抑制劑Calpain inhibitorⅣ和CDK5抑制劑Roscovitine腦立體定位注射到EPAC2-/-小鼠側(cè)腦室,用免疫印跡檢測(cè)是否對(duì)EPAC2下調(diào)導(dǎo)致的Tau過度磷酸化有修復(fù)作用。 [結(jié)果] 1、EPAC2下調(diào)導(dǎo)致Tau蛋白過度磷酸化,不可溶Tau蛋白增加、神經(jīng)纖維纏結(jié)形成等Tau病變。 為了探討EPAC2下調(diào)對(duì)Tau蛋白的影響,我們首先應(yīng)用EPAC2-/-轉(zhuǎn)基因小鼠和si-EPAC2質(zhì)粒在動(dòng)物和細(xì)胞水平造成EPAC2下調(diào)的環(huán)境,再取樣分析Tau蛋白的磷酸化程度。結(jié)果顯示從6月齡開始,EPAC2下調(diào)后Tau蛋白磷酸化水平增加,pT205、 pT231、pS396、pS4O4位點(diǎn)的磷酸化程度也增加。隨后我們把6月齡EPAC2+/+和EPAC2-/-小鼠腦組織樣品分為可溶組分和不可溶組分,發(fā)現(xiàn)EPAC2-/-、鼠的Tau蛋白在不可溶組分中明顯增加。Bielschowsky銀染顯示,EPAC2-/-小鼠腦內(nèi)9月齡時(shí)即出現(xiàn)明顯Tau過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。 2、EPAC2下調(diào)通過激活CDK5影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。 Tau蛋白磷酸化是相關(guān)激酶酯酶調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果,為了找出在EPAC2下調(diào)體系中影響Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵因子,我們對(duì)相關(guān)激酶酯酶進(jìn)行了篩查,最后發(fā)現(xiàn)CDK5在EPAC2下調(diào)后活性成分表達(dá)明顯增加,下調(diào)CDK5可逆轉(zhuǎn)EPAC2下調(diào)引起的Tau蛋白過度磷酸化。 3. EPAC2下調(diào)通過激活Calpain活化CDK5。 Calpain是調(diào)節(jié)CDK5活性主要因子,檢測(cè)顯示EPAC2-/-小鼠Calpain活性明顯高于EPAC2+/+小鼠。在EPAC2-/-小鼠體內(nèi)下調(diào)Calpain后CDK5活性降低,Tau磷酸化病變得到逆轉(zhuǎn)。 4、EPAC2下調(diào)激活TGF-β1/Calpain/CDK5通路影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。 經(jīng)驗(yàn)證,EPAC2對(duì)Calpain. CDK5的激活不是通過傳統(tǒng)的Ca2+活化造成的,為了找到EPAC2對(duì)CDK5的調(diào)節(jié)作用,我們篩選出TGF-β1這個(gè)炎癥因子,進(jìn)一步通過TGF-β1/Calpain/CDK5通路進(jìn)行研究。 [結(jié)論] 1、EPAC2下調(diào)導(dǎo)致Tau蛋白過度磷酸化,不可溶Tau蛋白增加、神經(jīng)纖維纏結(jié)形成等Tau病變。 2、EPAC2下調(diào)通過激活CDK5影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。 3、EPAC2下調(diào)通過激活Calpain活化CDK5。 4、EPAC2下調(diào)激活TGF-β1/Calpain/CDK5通路影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。
[Abstract]:[background]
Alzheimer's Disease (AD) is a common, progressive, fatal neurodegenerative disease. Its main pathological feature is the formation of neurogenic fibrous tangles (NFTs) and extracellular senile plaques (SPs) in the neurons of the brain. The main component of the.NFTs is over phosphorylated Tau bereavement of the abnormal phosphorylation of Tau.. The function of microtubule assembly and stabilization of microtubules and the aggregation of PHF, which eventually lead to the formation of NFTs, the degeneration of synapses and the loss of neurons, play a key role in the development of AD.
Guanine nucleotide exchange protein (EPAC) is a downstream protein directly activated by cAMP, which plays an important role in the regulation of biological processes..EPAC1/2 knockout mice show learning memory and social interaction, and the EPAC2 subtype decreases in the]nRNA level in the brain of AD patients, suggesting that the EPAC2 downregulation is involved in the course regulation of AD. However, EPAC2 signal It is not clear how to regulate the related pathways in vivo and thus affect learning and memory.
[Objective]
Objective to investigate the regulatory mechanism of EPAC2 regulated signaling pathway on abnormal overphosphorylation of Tau protein, and explore how to reverse learning and memory impairment induced by EPAC2 downregulation.
[method]
In the study of the regulation mechanism of abnormal overphosphorylation of Tau protein by EPAC2 signaling pathway, we applied EPAC2-/- transgenic mice and si-EPAC2 plasmids. The expression of Tau protein phosphorylation related antibodies was detected by immunoblot test at the overall level and cell level, and the soluble and insoluble protein components were separated to Tau. In order to verify whether there is a neurofibrillary tangles caused by excessive phosphorylation of Tau protein, we have carried out Bielschowsky silver staining.
In order to explore the mechanism that causes the results, we screened a series of kinase esterases associated with the phosphorylation of Tau protein by immunoblotting. We found that the key kinase CDK5 regulating the phosphorylation of Tau protein was activated. Then, the CDK5 upstream factor Calpain was found and the activity detection was found according to the literature study. In order to explain the downregulation of EPAC2 and Calpain In association, ELISA was used to screen out the TGF and beta 1 intermediate linkage factor of EPAC2 and Calpain from multiple immune factors.
In order to reverse the Tau lesion caused by EPAC2 downregulation, we injected the Calpain inhibitor Calpain inhibitor IV and CDK5 inhibitor Roscovitine stereotaxic into the lateral ventricle of EPAC2-/- mice, and the immunoblotting was used to detect the repair of Tau overphosphorylation caused by EPAC2 downregulation.
[results]
1, down regulation of EPAC2 results in excessive phosphorylation of Tau protein, increased insoluble Tau protein, and formation of Tau lesions such as nerve fiber entanglement.
In order to investigate the effect of EPAC2 down regulation on Tau protein, we first used EPAC2-/- transgenic mice and si-EPAC2 plasmids to cause EPAC2 downregulation in animal and cell levels, and then sample and analyze the phosphorylation of Tau protein. The results showed that the level of Tau protein phosphorylation increased after EPAC2 downregulation, pT205, pT231, pS396, pS4O4 sites. The degree of phosphorylation was also increased. Then we divided the brain tissue samples of 6 month old EPAC2+/+ and EPAC2-/- mice into soluble components and insoluble components. It was found that EPAC2-/-, the Tau protein in the insoluble components increased obviously in the insoluble components, and the.Bielschowsky silver staining was found in the insoluble components of the EPAC2-/- mice. The neurons of Tau overphosphorylation appeared in the brain of EPAC2-/- mice. Fiber tangles.
2, EPAC2 downregulates the phosphorylation of Tau protein through activation of CDK5.
The phosphorylation of Tau protein is the result of the imbalance of the related kinase esterase regulation. In order to find out the key factor affecting the phosphorylation of Tau protein in the down regulation of EPAC2, we screened the related kinase esterase. Finally, it was found that the expression of CDK5 was obviously increased after the downregulation of EPAC2, and the lower modulation of CDK5 could reverse the Tau protein overregulation caused by the downregulation of EPAC2. Phosphorylation.
3. EPAC2 down regulated by activating Calpain to activate CDK5.
Calpain was the main factor regulating the activity of CDK5. The detection showed that the activity of Calpain in EPAC2-/- mice was significantly higher than that of EPAC2+/+ mice. The activity of CDK5 was reduced and the Tau phosphorylation lesion was reversed in the EPAC2-/- mice.
4, EPAC2 downregulates the activation of TGF- beta 1/Calpain/CDK5 pathway and regulates the phosphorylation of Tau protein.
It was verified that the activation of Calpain. CDK5 by EPAC2 was not caused by traditional Ca2+ activation. In order to find the regulatory role of EPAC2 to CDK5, we screened the inflammatory factor of TGF- beta 1 and further studied the TGF- beta 1/Calpain/CDK5 pathway.
[Conclusion]
1, down regulation of EPAC2 results in excessive phosphorylation of Tau protein, increased insoluble Tau protein, and formation of Tau lesions such as nerve fiber entanglement.
2, EPAC2 downregulates the phosphorylation of Tau protein through activation of CDK5.
3, EPAC2 downregulation activates Calpain by activating CDK5.
4, EPAC2 downregulates the activation of TGF- beta 1/Calpain/CDK5 pathway and regulates the phosphorylation of Tau protein.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2058673