發(fā)布時間：2018-06-03 01:44

  本文選題：母愛剝奪 + 慢性輕度應(yīng)激　； 參考：《武漢大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：目的 抑郁癥是一種發(fā)病率較高的一種精神疾病,具有高致殘性。在整個生命周期中,有15%以上的人群受到抑郁癥的困擾,為家庭和社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。目前有共識認(rèn)為抑郁是基因與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果,然而神經(jīng)病理學(xué)機(jī)制仍不清楚。經(jīng)典的單胺假說認(rèn)為：5-HT、去甲腎上腺素、多巴胺等單胺神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏或不平衡是抑郁癥發(fā)病的機(jī)制。雖然抗抑郁增強(qiáng)單胺系統(tǒng)效應(yīng)的作用支持了這一假說,但是部分患者對抗抑郁藥物反應(yīng)不佳,而且一般在治療幾周或幾個月后,藥物臨床療效才出現(xiàn)。所以,單胺遞質(zhì)減少可能僅僅是導(dǎo)致抑郁癥的起點機(jī)制。 臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),生命早期遭受創(chuàng)傷事件的人群,成年抑郁癥易感性增加。基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn),早年遭受應(yīng)激的嚙齒類動物,成年后有抑郁樣行為。同時研究也發(fā)現(xiàn),抑郁癥患者存在海馬結(jié)構(gòu)異常,如海馬萎縮,神經(jīng)元體積縮小、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞密度減低等。近年來,大量研究已經(jīng)證實,哺乳動物海馬存在新生的神經(jīng)元,這些新生神經(jīng)元不斷填補(bǔ)到海馬齒狀回中,維持海馬的正常生理功能。因此,多個易感基因與環(huán)境因素影響下的大腦特殊結(jié)構(gòu)的神經(jīng)可塑性紊亂可能是抑郁癥發(fā)病的原因。 BDNF和CREB被認(rèn)為對神經(jīng)元的再生、存活、分化、生長發(fā)育起重要作用,有著防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元病理狀態(tài)、促進(jìn)神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng),因此BDNF和CREB對維持中樞神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和生理功能具有重要的作用。BDNF和CREB的mRNA表達(dá)和蛋白水平降低將影響海馬的神經(jīng)再生等神經(jīng)可塑性,影響海馬的正常功能。 研究還顯示,海馬BDNF和CREB的mRNA表達(dá)和蛋白水平會影響海馬的神經(jīng)可塑性,而海馬神經(jīng)的可塑性又可能與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)。其他研究顯示,生命早期應(yīng)激可以增加成年抑郁易感性。因此,我們推測生命早期應(yīng)激會改變海馬神經(jīng)再生、BDNF和CREB的mRNA表達(dá)和蛋白,導(dǎo)致抑郁易感性增加。在后期不良環(huán)境因素的影響下,可能導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生。 為了論證我們的推測,本研究旨在探討早年應(yīng)激對成年大鼠海馬神經(jīng)再生、海馬BDNFmRNA和蛋白、CREBmRNA和蛋白水平以及行為的影響；遭受早年應(yīng)激的成年大鼠遭受慢性不可預(yù)見輕度應(yīng)激時的行為和海馬BDNFmRNA和蛋白CREBmRNA和蛋白水平的變化。 方法 1.分組 健康成年雌雄SD大鼠合籠,交配繁殖下一代。幼鼠出生后,移去雄性大鼠,留下母鼠與新生幼鼠在一起。挑出新生雄性幼鼠分為下列4組： ①正常對照組：出生后至第90天正常喂養(yǎng); ②MD組：出生后第2天至第14天,每天與母鼠分離3h,第15天開始正常喂養(yǎng)至第90天； ③CUMS組：出生后至第90天正常喂養(yǎng),而后給予21天的慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激； ④雙重應(yīng)激組：出生后第2天至第14天,每天與母鼠分離3h,第15天開始正常喂養(yǎng)至第90天,而后給予21天的慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激。 2.應(yīng)激模型的建立 ①M(fèi)D模型：大鼠于出生后的第2天至第14天每天接受3h的母親分離。每天9：30把幼鼠從母鼠巢中移出,單獨(dú)放置于干凈的盒子中,底部鋪墊母巢中的木屑,溫度與母巢一致,12：30再把幼鼠移回母巢中。 ②CUMS模型：大鼠連續(xù)21天接受各種不同的不可預(yù)知的輕度應(yīng)激：禁水(24h),禁食(48h),夾尾(1min),熱刺激(45℃水浴,5min),明暗顛倒(24h),束縛(2h,2次),冰水游泳(4℃,5min)。每天采取的應(yīng)激方式隨意抽取。應(yīng)激期間每只大鼠一個籠子孤養(yǎng)。 3.行為觀察 ①糖水偏好測驗：試驗前先禁水禁食24h,然后每只大鼠同時給予事先稱重的2瓶水(一瓶為1%蔗糖水,另一瓶為自來水),60min后,取走2瓶進(jìn)行定量,計算每只大鼠糖水偏愛百分比[糖水消耗量/(糖水消耗量+普通自來水消耗量)×100%]。糖水偏好降低反映快感缺乏,為抑郁癥的核心癥狀之一。正常對照組、MD組在出生第90天進(jìn)行糖水偏好測驗,CUMS組和雙重應(yīng)激組在CUMS前后進(jìn)行糖水偏好測驗。 ②曠場測驗：實驗在一個安靜的房間內(nèi)進(jìn)行,時間均在9：00--12：00進(jìn)行,2次測試房間溫度、濕度相同。動物的活動情況采用動物運(yùn)動軌跡記錄分析系統(tǒng)(Ethovision系統(tǒng),荷蘭Noldus公司)采集和分析。曠場為120cmx90cmx35cm鐵質(zhì)敞箱,底部平分為25個方格,外圍16個方格視為外圍場地,中間9個方格視為內(nèi)圍場地。實驗于早9：0012：00進(jìn)行。實驗時手提大鼠尾巴將大鼠輕輕放在箱底中心方格內(nèi),電腦開始記時,攝像頭記錄大鼠10min的行為,包括總行程、內(nèi)圍場地行程、直立次數(shù)。總行程直接反映動物的興奮程度,內(nèi)圍場地行程反映大鼠的焦慮水平,直立次數(shù)反映大鼠的探索能力。正常對照組、MD組在出生第90天進(jìn)行曠場測驗,CUMS組和雙重應(yīng)激組在CUMS后進(jìn)行曠場測驗。 4. BrdU標(biāo)記和免疫組化方法檢測海馬齒狀回神經(jīng)再生數(shù)量 糖水偏好測驗和曠場測驗結(jié)束后第2天,對正常對照組(n=12),MD組(n=12)用BrdU標(biāo)記和免疫組化方法檢測海馬齒狀回神經(jīng)再生的數(shù)量。 ①BrdU標(biāo)記給大鼠腹腔注射BrdU (50mg/kg).每3h注射1次,共注射3次。24h后麻醉大鼠。經(jīng)生理鹽水和含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液灌注固定。斷頭后,取出腦組織并進(jìn)行再固定和脫水、包埋存于-70℃低溫冰箱。 ②免疫組化方法檢測海馬齒狀回神經(jīng)再生取出冰凍的大鼠腦組織,對其作連續(xù)冠狀冰凍切片,每隔3張取1張切片組成1套；每套切片約5張,每片厚30μm,然后對上述切片,以BrdU小鼠單克隆抗體為一抗,生物素化小鼠抗體為二抗,進(jìn)行免疫組化對海馬齒狀回BrdU標(biāo)記細(xì)胞顯色,并顯微鏡下計數(shù)。 5. RT-PCR方法檢測海馬BDNFmRNA、CREBmRNA的表達(dá)水平 正常對照組(n=12)、MD組(n=12)在糖水偏好測驗和曠場測驗結(jié)束后第2天以及CUMS組(n=12)和雙重應(yīng)激組(n=12)在CUMS后第2天斷頭,在冰凍鋁盤上分離出海馬,并儲存在-70℃。樣本化凍、粉碎,用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)方法檢測海馬BDNF和CREB的mRNA表達(dá)水平。采用GAPDH作為內(nèi)參,以測得樣品BDNF和CREB產(chǎn)物值除以GAPDH值,最終得到的比值為BDNFmRNA和CREB mRNA的相對含量。 6. Western blot方法檢測海馬BDNF和CREB的蛋白水平 取標(biāo)本方法同RT-PCR方法。使用兔單克隆抗CREB抗體和兔單克隆抗BDNF抗體,用考馬斯亮藍(lán)染色法標(biāo)記。以β-actin蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)參,以各樣本與相應(yīng)內(nèi)參灰度值比值為蛋白相對含量。 結(jié)果 1.MD對成年雄性大鼠行為和海馬齒狀回神經(jīng)再生的影響的結(jié)果： (1)糖水偏好百分比,MD組明顯少于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01); (2)大鼠在曠場內(nèi)10分鐘行為：曠場總行程、內(nèi)圍場地行程、直立次數(shù),MD組均明顯少于正常對照組(P0.05)。 (3)MD組海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 2.MD對成年雄性大鼠行為和海馬BDNFmRNA和蛋白、CREBmRNA和蛋白的影響的結(jié)果： (1)糖水偏好百分比,MD組明顯少于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)： (2)大鼠在曠場內(nèi)10分鐘行為：曠場總行程、內(nèi)圍場地行程、直立次數(shù),MD組均明顯少于正常對照組(P0.05)； (3) BDNF和CREB的mRNA表達(dá)及蛋白水平,MD組均明顯低于正常對照組(P0.05)。 3.CUMS和雙重應(yīng)激對成年大鼠行為和海馬BDNFmRNA和蛋白、CREBmRNA和蛋白的影響的結(jié)果： (1)糖水偏好百分比,母愛剝奪組、CUMS組、雙重應(yīng)激組明顯低于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);CUMS組低于雙重應(yīng)激組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 (2)大鼠在曠場內(nèi)10分鐘行為：曠場總行程、內(nèi)圍場地行程、直立次數(shù),母愛剝奪組、CUMS組、雙重應(yīng)激組明顯低于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)：CUMS組低于雙重應(yīng)激組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 (3) BDNFmRNA和CREBmRNA表達(dá)水平,母愛剝奪組、CUMS組、雙重應(yīng)激組明顯低于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);CUMS組低于雙重應(yīng)激組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 (4) BDNF蛋白和CREB蛋白水平,母愛剝奪組、CUMS組、雙重應(yīng)激組明顯低于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);CUMS組低于雙重應(yīng)激組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 (1)早年應(yīng)激、成年慢性輕度應(yīng)激和雙重應(yīng)激都可以影響行為和海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子； (2)早年應(yīng)激改變成年大鼠海馬齒狀回神經(jīng)再生以及海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子水平,使大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為,可能增加抑郁易感性； (3)早年應(yīng)激改變成年后慢性輕度應(yīng)激的行為反應(yīng)和海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)節(jié),導(dǎo)致對慢性輕度應(yīng)激反應(yīng)遲鈍。 (4)早年應(yīng)激對海馬產(chǎn)生的長期影響可能增加抑郁癥易感性,抑郁的發(fā)病還需要進(jìn)一步的環(huán)境因素。
[Abstract]:Purpose

Depression is a high incidence of mental illness , with high disability . In the whole life cycle , more than 15 % of the population is suffering from depression . There is a consensus that depression is the result of the interaction of genes with environmental factors . However , there is consensus that depression is the result of the interaction of genes with environmental factors . However , neuropathology mechanisms are still unclear . Although the effect of anti - depressant monoamines system supports this hypothesis , some patients have not been able to respond to antidepressants .

In recent years , a number of studies have shown that there is abnormal hippocampal formation in the hippocampus of mammals , such as atrophy of the hippocampus , shrinking of neurons and density of glial cells . In recent years , a large number of studies have shown that the hippocampus of mammals has neonatal neurons , which have been continuously filled into dentate gyrus of hippocampus and maintained the normal physiological function of the hippocampus .

BDNF and CREB play an important role in the regeneration , survival , differentiation and development of neurons . BDNF and CREB play an important role in maintaining the normal structure and physiological function of the neurons . BDNF and CREB play an important role in maintaining the normal structure and physiological function of the central nervous system .

The study also shows that the mRNA expression and protein level of BDNF and CREB in hippocampus can affect the neuroplasticity of hippocampus , while the plasticity of hippocampus nerve may be related to the onset of depression . Other studies show that early life stress can increase adult depression susceptibility . Therefore , we hypothesized that early life stress could alter the mRNA expression and protein of hippocampus nerve regeneration , BDNF and CREB , resulting in increased depression susceptibility . Under the influence of adverse environmental factors , depression could lead to depression .

In order to demonstrate our speculation , the aim of this study was to investigate the effects of early - year stress on hippocampus nerve regeneration , BDNFmRNA and protein , CREB mRNA and protein levels and behavior of adult rats .
Adult rats suffering from early stress were subjected to chronic unpredictable mild stress and changes in BDNFmRNA and protein CREB mRNA and protein levels in hippocampus .

method

1 . Grouping

Healthy adult male and female SD rats were mated to reproduce the next generation . After birth , the male rats were removed , leaving the female mouse together with the neonatal mice . The newborn male mice were selected to be divided into the following 4 groups :

( 1 ) Normal control group : normal feeding after birth to Day 90 ;

( 2 ) MD group : 2 days to 14 days after birth , 3 hours were separated from female rats every day , and normal feeding was started on Day 15 to 90 days ;


( 3 ) CUMS group : normal feeding to 90 days after birth and 21 days of chronic mild unpredictable stress ;


( 4 ) Double stress group : 2 days to 14 days after birth , 3 hours were separated from female rats every day , normal feeding was started on Day 15 to 90 days , and then 21 days of chronic mild unpredictable stress were given .

2 . Establishment of stress model

( 1 ) MD model : The rats received 3 hours of mother separation from day 2 to day 14 after birth . 9 : 30 days a day , the young rats were removed from the nest of the mother mouse , placed separately in a clean box , the wood chips in the mother nest were placed at the bottom , the temperature was consistent with the female nest , and 12 : 30 the young rats were moved back to the mother nest .

( 2 ) CUMS model : rats received various unpredictable mild stress ( 24h ) , fasting ( 48h ) , tail ( 1 min ) , thermal stimulation ( 45 鈩，

本文編號：1970983