本文選題：β-淀粉樣蛋白 + EphB2��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：阿爾茨海默�。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的，以學(xué)習(xí)記憶減退和認(rèn)知功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病。AD的病理學(xué)特征為細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積形成的老年斑，高度磷酸化的tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及腦內(nèi)神經(jīng)元和突觸的丟失。目前認(rèn)為Aβ沉積是AD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，AD患者學(xué)習(xí)記憶的損傷程度與細(xì)胞外Aβ沉積密切相關(guān)，但Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷的具體機(jī)制還不清楚，仍需要進(jìn)一步研究。 Eph是受體酪氨酸激酶中最大的家族，主要分布在興奮性突觸，在發(fā)育過程中參與組織形成，血管的發(fā)生和軸突導(dǎo)向等，在成熟的腦內(nèi)也發(fā)揮重要作用，參與突觸功能和可塑性的調(diào)節(jié)。目前的研究主要集中在EphA4和EphB2，這兩種受體廣泛分布于大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)。最近研究發(fā)現(xiàn)，在AD轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2575腦內(nèi)，EphB2的表達(dá)出現(xiàn)年齡和區(qū)域依賴性的降低。在hAPP（Human amyloid precursor protein，hAPP）轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病早期，海馬內(nèi)也出現(xiàn)了EphB2表達(dá)的降低，在海馬齒狀回過表達(dá)EphB2質(zhì)粒，能夠逆轉(zhuǎn)N-甲基-D-天門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acidreceptor，NMDAR）依賴的長時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP）的降低，同時(shí)也恢復(fù)了hAPP轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，推測EphB2表達(dá)的降低與AD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，而AD患者和AD動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶能力下降的主要原因是Aβ的沉積，由此推測EphB2水平的降低可能是Aβ誘導(dǎo)的突觸可塑性下降和神經(jīng)元丟失的原因，目前仍缺乏直接證據(jù)。 Aβ寡聚體沉積所引起的神經(jīng)元功能損傷和神經(jīng)毒性作用與NMDAR活性的失調(diào)有關(guān)，谷氨酸能神經(jīng)元運(yùn)輸和功能失調(diào)是AD病理的主要原因之一，NMDAR在突觸和突觸外位點(diǎn)表達(dá)的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的存活有著關(guān)鍵性的作用。EphB2通過調(diào)節(jié)NMDAR的功能而調(diào)節(jié)谷氨酸能的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，很多研究已經(jīng)證實(shí)EphB2在突觸可塑性中的關(guān)鍵作用，EphB的激活能夠誘導(dǎo)Src激酶-依賴性的NR2B三個(gè)酪氨酸殘基的磷酸化，這對(duì)于調(diào)節(jié)NMDAR在突觸的表達(dá)非常重要。敲除EphB1-3三個(gè)基因的小鼠，興奮性突觸的數(shù)量減少，而只敲除EphB2基因的小鼠，NMDAR在突觸的電流降低，海馬的LTP也受到抑制，說明EphB2可能對(duì)于NMDAR在突觸的表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用。 最近研究發(fā)現(xiàn)，NMDAR的激活所誘導(dǎo)的一系列反應(yīng)決定于NMDAR的亞細(xì)胞定位。激活突觸NMDAR，促進(jìn)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）的磷酸化和細(xì)胞的存活，而激活突觸外NMDAR，抑制CREB信號(hào)途徑并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在海馬神經(jīng)元，CREB是細(xì)胞核Ca2+信號(hào)的重要靶標(biāo)，在神經(jīng)元存活、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶中都具有重要的作用。CREB受到多種信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)，其中包括細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)途徑，而p38MAPK參與了Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用以及NMDAR依賴性的LTP抑制。 因此，我們推測在海馬神經(jīng)元內(nèi)，Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用可能是由于突觸和突觸外NMDAR的失衡所致，而EphB2則通過調(diào)節(jié)NMDAR在突觸的表達(dá)及其下游的p38MAPK和CREB信號(hào)通路而對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷起到保護(hù)作用。本研究通過原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用MTT、LDH以及形態(tài)學(xué)方法，觀察Aβ1-42的神經(jīng)毒性損傷作用。以轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒的方法，提高海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達(dá)，進(jìn)而探討EphB2對(duì)于NMDAR在突觸的表達(dá)以及p38MAPK和CREB信號(hào)通路的影響。第一部分EphB2對(duì)Aβ寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷的保護(hù)作用 目的：觀察Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性損傷作用以及對(duì)EphB2表達(dá)的影響，探討EphB2表達(dá)水平與Aβ1-42神經(jīng)毒性損傷間的關(guān)系。 方法：新生1d內(nèi)SD乳鼠，剝離兩側(cè)海馬進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至神經(jīng)元成熟以后，以NeuN神經(jīng)元特異性抗體和Hoechst33258雙染鑒定神經(jīng)元純度，神經(jīng)元純度在90%以上的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過神經(jīng)元形態(tài)學(xué)、Hoechst33258染色以及LDH和MTT檢測的方法，觀察1μM Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元1，3，6，24h后，對(duì)神經(jīng)元的毒性損傷作用。Western blot檢測Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2表達(dá)水平的影響。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，觀察EphB2對(duì)Aβ1-42神經(jīng)毒性損傷的作用。 結(jié)果： 1原代培養(yǎng)的成熟海馬神經(jīng)元，胞體較大，周圍光暈明顯，胞漿飽滿，胞核大，神經(jīng)元突起交織成網(wǎng)絡(luò)。1μM的Aβ1-42處理1，3，6，24h后，神經(jīng)元數(shù)量隨Aβ1-42處理時(shí)間的延長呈逐漸減少的趨勢，部分細(xì)胞胞體腫脹，失去折光性，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒，有些胞膜破裂，有大量碎片生成。Hoechst33258染色顯示，隨著Aβ1-42處理時(shí)間的延長，神經(jīng)元細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)斷裂凝集顯著增多，熒光強(qiáng)度逐漸增加。 2MTT檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，在Aβ1-42處理1，3，6，24h后，神經(jīng)元的存活率逐漸下降，與對(duì)照組相比，均存在顯著性差異。 3檢測培養(yǎng)液中LDH釋放率，結(jié)果顯示，在Aβ1-42處理1，3，6，24h后，LDH釋放率隨Aβ1-42處理時(shí)間的延長而顯著增加，與對(duì)照組相比，均存在顯著性差異。 4Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，顯著降低了EphB2的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，增加了海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達(dá)，使Aβ1-42處理后的海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達(dá)恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。 5MTT和LDH檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理1h和3h后，細(xì)胞存活率升高，LDH釋放率下降，與單獨(dú)Aβ1-42處理1h和3h組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理6h和24h后，細(xì)胞存活率和LDH釋放率與單獨(dú)Aβ1-42處理6h和24h之間無顯著性差異。結(jié)果表明在Aβ1-42毒性損傷早期，轉(zhuǎn)染EphB2具有保護(hù)作用，因此，后面相關(guān)實(shí)驗(yàn)Aβ1-42處理的時(shí)間均為1h。 結(jié)論： Aβ1-42對(duì)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元具有時(shí)間依賴性的毒性損傷作用，同時(shí)，Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，細(xì)胞內(nèi)EphB2的表達(dá)水平下降。通過轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒增加神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達(dá)水平，能夠抑制Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性損傷作用。第二部分EphB2對(duì)Aβ寡聚體誘導(dǎo)的NMDAR在突觸表達(dá)改變的影響 目的：觀察AD動(dòng)物模型SAMP8小鼠和AD細(xì)胞模型中NMDAR在突觸表達(dá)的變化，并在AD細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，探討EphB2對(duì)于NMDAR在突觸表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 方法：以6月齡SAMP8小鼠作為AD動(dòng)物模型，通過生物化學(xué)方法，分離海馬突觸蛋白，檢測NMDAR各亞基在突觸表達(dá)的變化。Aβ1-42處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)的方法，進(jìn)一步觀察在AD細(xì)胞模型中NMDAR各亞基在突觸表達(dá)的變化。再通過轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，增加AD細(xì)胞膜型中EphB2的表達(dá)，進(jìn)而觀察EphB2對(duì)于NMDAR各亞基在突觸表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果： 1Western blot結(jié)果顯示， NR1、NR2A和NR2B在突觸表達(dá)占NR1、NR2A和NR2B表達(dá)總量的比值在SAMP8、SAMR1和CD-1三組間存在顯著性差異，SAMP8小鼠顯著低于SAMR1和CD-1小鼠（P＜0.01），SAMR1和CD-1小鼠間沒有顯著性差異。 2Aβ1-42處理的原代海馬神經(jīng)元，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)檢測NMDAR三個(gè)亞基在突觸的表達(dá)變化。NR1、NR2A和NR2B在突觸表達(dá)的量占NR1、NR2A和NR2B表達(dá)總量的比值在對(duì)照組（Con）與Aβ1-42處理組（Aβ）間存在顯著差異，Aβ1-42處理使NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達(dá)分別下降29.18%（P＜0.01）、17.98%（P＜0.01）和24.67%（P＜0.01）。 3在海馬神經(jīng)元內(nèi)，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）顯著增加了NR1和NR2B在突觸的表達(dá)，比單獨(dú)的Aβ1-42處理組（Aβ）分別增加17.95%（P＜0.01）和19.31%（P＜0.01）。NR2A在突觸的表達(dá)未受到轉(zhuǎn)染EphB2的顯著影響，在轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）與單獨(dú)的Aβ1-42處理組（Aβ）之間無顯著性差異，仍顯著少于對(duì)照組（Con）（P＜0.01）。 結(jié)論： AD動(dòng)物模型SAMP8小鼠，NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達(dá)顯著下降。Aβ1-42處理的海馬神經(jīng)元也表現(xiàn)出NR1、NR2A和NR2B在突觸表達(dá)的顯著下降，轉(zhuǎn)染EphB2能抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NR1和NR2B在突觸表達(dá)的降低，但對(duì)于NR2A在突觸的表達(dá)無顯著影響。第三部分EphB2對(duì)Aβ寡聚體誘導(dǎo)的p38MAPK和CREB信號(hào)通路的影響 目的：探討EphB2在AD細(xì)胞模型中對(duì)于p38MAPK和CREB信號(hào)通路的影響。 方法：Aβ1-42處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用western blot檢測p38MAPK和CREB的磷酸化水平。進(jìn)而通過轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，增加AD細(xì)胞模型中EphB2的表達(dá)水平，觀察EphB2對(duì)于p38MAPK和CREB磷酸化水平的影響。 結(jié)果： 1與對(duì)照組（Con）相比，p38MAPK磷酸化水平在Aβ1-42處理組（Aβ）顯著升高（P＜0.01），轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）和單獨(dú)轉(zhuǎn)染EphB2組（EphB2）與對(duì)照組間無顯著性差異。與Aβ1-42處理組（Aβ）相比，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）的p38MAPK磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒后Aβ1-42處理組（iEphB2+Aβ）與Aβ1-42處理組（Aβ）間無顯著性差異。 2與對(duì)照組（Con）相比，CREB磷酸化水平在Aβ1-42處理組（Aβ）顯著降低（P＜0.01），轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）和單獨(dú)轉(zhuǎn)染EphB2組（EphB2）與對(duì)照組間無顯著性差異。與Aβ1-42處理組（Aβ）相比，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）的CREB磷酸化水平顯著升高（P＜0.01），轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒后Aβ1-42處理組（iEphB2+Aβ）與Aβ1-42處理組（Aβ）間無顯著性差異。 結(jié)論： Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，p38MAPK磷酸化水平顯著升高，而CREB的磷酸化水平顯著降低。過表達(dá)EphB2能夠抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的p38MAPK磷酸化水平的升高和CREB磷酸化水平的降低。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以Aβ1-42處理原代海馬神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型，應(yīng)用形態(tài)學(xué)、MTT、LDH釋放率、免疫細(xì)胞化學(xué)、western blot等方法，研究EphB2對(duì)于Aβ1-42神經(jīng)毒性的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42對(duì)于海馬神經(jīng)元具有時(shí)間依賴性的神經(jīng)毒性作用，并導(dǎo)致EphB2表達(dá)水平的降低。在海馬神經(jīng)元內(nèi)過表達(dá)EphB2能夠抑制Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性損傷，且在Aβ1-42處理1h的時(shí)候，EphB2的保護(hù)作用最為顯著，因此，本實(shí)驗(yàn)采用Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元1h的模型來研究EphB2的作用機(jī)制。Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元內(nèi)NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達(dá)顯著下降，過表達(dá)EphB2能夠抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NR1和NR2B在突觸表達(dá)的降低，提示在Aβ1-42誘導(dǎo)的毒性損傷模型中，EphB2具有調(diào)節(jié)NMDAR在突觸表達(dá)的功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42誘導(dǎo)的p38MAPK的磷酸化升高以及CREB磷酸化的降低，，都能夠通過增加EphB2的表達(dá)水平而得以恢復(fù)�？傊�，本研究結(jié)果提示EphB2通過提高NMDAR在突觸的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)突觸NMDAR下游信號(hào)通路p38MAPK和CREB的激活而對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性起到保護(hù)作用，初步揭示了EphB2神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制，為AD的治療提供了新的思路和方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R749.1

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本文編號(hào)：1884946