本文選題：β-淀粉樣蛋白 + EphB2　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2013年博士論文

【摘要】：阿爾茨海默�。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的，以學習記憶減退和認知功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病。AD的病理學特征為細胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積形成的老年斑，高度磷酸化的tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及腦內(nèi)神經(jīng)元和突觸的丟失。目前認為Aβ沉積是AD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，AD患者學習記憶的損傷程度與細胞外Aβ沉積密切相關(guān)，但Aβ誘導神經(jīng)毒性損傷的具體機制還不清楚，仍需要進一步研究。 Eph是受體酪氨酸激酶中最大的家族，主要分布在興奮性突觸，在發(fā)育過程中參與組織形成，血管的發(fā)生和軸突導向等，在成熟的腦內(nèi)也發(fā)揮重要作用，參與突觸功能和可塑性的調(diào)節(jié)。目前的研究主要集中在EphA4和EphB2，這兩種受體廣泛分布于大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)。最近研究發(fā)現(xiàn)，在AD轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2575腦內(nèi)，EphB2的表達出現(xiàn)年齡和區(qū)域依賴性的降低。在hAPP（Human amyloid precursor protein，hAPP）轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病早期，海馬內(nèi)也出現(xiàn)了EphB2表達的降低，在海馬齒狀回過表達EphB2質(zhì)粒，能夠逆轉(zhuǎn)N-甲基-D-天門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acidreceptor，NMDAR）依賴的長時程增強（long term potentiation，LTP）的降低，同時也恢復了hAPP轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶障礙，推測EphB2表達的降低與AD的發(fā)病機制相關(guān)，而AD患者和AD動物模型學習記憶能力下降的主要原因是Aβ的沉積，由此推測EphB2水平的降低可能是Aβ誘導的突觸可塑性下降和神經(jīng)元丟失的原因，目前仍缺乏直接證據(jù)。 Aβ寡聚體沉積所引起的神經(jīng)元功能損傷和神經(jīng)毒性作用與NMDAR活性的失調(diào)有關(guān)，谷氨酸能神經(jīng)元運輸和功能失調(diào)是AD病理的主要原因之一，NMDAR在突觸和突觸外位點表達的動態(tài)平衡對于神經(jīng)細胞的存活有著關(guān)鍵性的作用。EphB2通過調(diào)節(jié)NMDAR的功能而調(diào)節(jié)谷氨酸能的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，很多研究已經(jīng)證實EphB2在突觸可塑性中的關(guān)鍵作用，EphB的激活能夠誘導Src激酶-依賴性的NR2B三個酪氨酸殘基的磷酸化，這對于調(diào)節(jié)NMDAR在突觸的表達非常重要。敲除EphB1-3三個基因的小鼠，興奮性突觸的數(shù)量減少，而只敲除EphB2基因的小鼠，NMDAR在突觸的電流降低，海馬的LTP也受到抑制，說明EphB2可能對于NMDAR在突觸的表達有重要的調(diào)節(jié)作用。 最近研究發(fā)現(xiàn)，NMDAR的激活所誘導的一系列反應(yīng)決定于NMDAR的亞細胞定位。激活突觸NMDAR，促進cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）的磷酸化和細胞的存活，而激活突觸外NMDAR，抑制CREB信號途徑并導致細胞死亡。在海馬神經(jīng)元，CREB是細胞核Ca2+信號的重要靶標，在神經(jīng)元存活、突觸可塑性以及學習記憶中都具有重要的作用。CREB受到多種信號途徑的調(diào)節(jié)，其中包括細胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號途徑，而p38MAPK參與了Aβ介導的神經(jīng)毒性作用以及NMDAR依賴性的LTP抑制。 因此，我們推測在海馬神經(jīng)元內(nèi)，Aβ誘導的神經(jīng)毒性作用可能是由于突觸和突觸外NMDAR的失衡所致，而EphB2則通過調(diào)節(jié)NMDAR在突觸的表達及其下游的p38MAPK和CREB信號通路而對Aβ誘導的神經(jīng)毒性損傷起到保護作用。本研究通過原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用MTT、LDH以及形態(tài)學方法，觀察Aβ1-42的神經(jīng)毒性損傷作用。以轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒的方法，提高海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達，進而探討EphB2對于NMDAR在突觸的表達以及p38MAPK和CREB信號通路的影響。第一部分EphB2對Aβ寡聚體誘導的神經(jīng)毒性損傷的保護作用 目的：觀察Aβ1-42對海馬神經(jīng)元的毒性損傷作用以及對EphB2表達的影響，探討EphB2表達水平與Aβ1-42神經(jīng)毒性損傷間的關(guān)系。 方法：新生1d內(nèi)SD乳鼠，剝離兩側(cè)海馬進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至神經(jīng)元成熟以后，以NeuN神經(jīng)元特異性抗體和Hoechst33258雙染鑒定神經(jīng)元純度，神經(jīng)元純度在90%以上的用于后續(xù)實驗。通過神經(jīng)元形態(tài)學、Hoechst33258染色以及LDH和MTT檢測的方法，觀察1μM Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元1，3，6，24h后，對神經(jīng)元的毒性損傷作用。Western blot檢測Aβ1-42對海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2表達水平的影響。進一步通過轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，觀察EphB2對Aβ1-42神經(jīng)毒性損傷的作用。 結(jié)果： 1原代培養(yǎng)的成熟海馬神經(jīng)元，胞體較大，周圍光暈明顯，胞漿飽滿，胞核大，神經(jīng)元突起交織成網(wǎng)絡(luò)。1μM的Aβ1-42處理1，3，6，24h后，神經(jīng)元數(shù)量隨Aβ1-42處理時間的延長呈逐漸減少的趨勢，部分細胞胞體腫脹，失去折光性，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒，有些胞膜破裂，有大量碎片生成。Hoechst33258染色顯示，隨著Aβ1-42處理時間的延長，神經(jīng)元細胞核縮小，染色質(zhì)斷裂凝集顯著增多，熒光強度逐漸增加。 2MTT檢測細胞存活率，結(jié)果顯示，在Aβ1-42處理1，3，6，24h后，神經(jīng)元的存活率逐漸下降，與對照組相比，均存在顯著性差異。 3檢測培養(yǎng)液中LDH釋放率，結(jié)果顯示，在Aβ1-42處理1，3，6，24h后，LDH釋放率隨Aβ1-42處理時間的延長而顯著增加，與對照組相比，均存在顯著性差異。 4Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，顯著降低了EphB2的表達水平，與對照組相比有統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，增加了海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達，使Aβ1-42處理后的海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達恢復到正常對照組水平。 5MTT和LDH檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理1h和3h后，細胞存活率升高，LDH釋放率下降，與單獨Aβ1-42處理1h和3h組相比，均具有統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理6h和24h后，細胞存活率和LDH釋放率與單獨Aβ1-42處理6h和24h之間無顯著性差異。結(jié)果表明在Aβ1-42毒性損傷早期，轉(zhuǎn)染EphB2具有保護作用，因此，后面相關(guān)實驗Aβ1-42處理的時間均為1h。 結(jié)論： Aβ1-42對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元具有時間依賴性的毒性損傷作用，同時，Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，細胞內(nèi)EphB2的表達水平下降。通過轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒增加神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達水平，能夠抑制Aβ1-42對海馬神經(jīng)元的毒性損傷作用。第二部分EphB2對Aβ寡聚體誘導的NMDAR在突觸表達改變的影響 目的：觀察AD動物模型SAMP8小鼠和AD細胞模型中NMDAR在突觸表達的變化，并在AD細胞模型中轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，探討EphB2對于NMDAR在突觸表達的調(diào)節(jié)作用。 方法：以6月齡SAMP8小鼠作為AD動物模型，通過生物化學方法，分離海馬突觸蛋白，檢測NMDAR各亞基在突觸表達的變化。Aβ1-42處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用免疫熒光雙標的方法，進一步觀察在AD細胞模型中NMDAR各亞基在突觸表達的變化。再通過轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，增加AD細胞膜型中EphB2的表達，進而觀察EphB2對于NMDAR各亞基在突觸表達的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果： 1Western blot結(jié)果顯示， NR1、NR2A和NR2B在突觸表達占NR1、NR2A和NR2B表達總量的比值在SAMP8、SAMR1和CD-1三組間存在顯著性差異，SAMP8小鼠顯著低于SAMR1和CD-1小鼠（P＜0.01），SAMR1和CD-1小鼠間沒有顯著性差異。 2Aβ1-42處理的原代海馬神經(jīng)元，應(yīng)用免疫熒光雙標檢測NMDAR三個亞基在突觸的表達變化。NR1、NR2A和NR2B在突觸表達的量占NR1、NR2A和NR2B表達總量的比值在對照組（Con）與Aβ1-42處理組（Aβ）間存在顯著差異，Aβ1-42處理使NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達分別下降29.18%（P＜0.01）、17.98%（P＜0.01）和24.67%（P＜0.01）。 3在海馬神經(jīng)元內(nèi)，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）顯著增加了NR1和NR2B在突觸的表達，比單獨的Aβ1-42處理組（Aβ）分別增加17.95%（P＜0.01）和19.31%（P＜0.01）。NR2A在突觸的表達未受到轉(zhuǎn)染EphB2的顯著影響，在轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）與單獨的Aβ1-42處理組（Aβ）之間無顯著性差異，仍顯著少于對照組（Con）（P＜0.01）。 結(jié)論： AD動物模型SAMP8小鼠，NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達顯著下降。Aβ1-42處理的海馬神經(jīng)元也表現(xiàn)出NR1、NR2A和NR2B在突觸表達的顯著下降，轉(zhuǎn)染EphB2能抑制Aβ1-42誘導的NR1和NR2B在突觸表達的降低，但對于NR2A在突觸的表達無顯著影響。第三部分EphB2對Aβ寡聚體誘導的p38MAPK和CREB信號通路的影響 目的：探討EphB2在AD細胞模型中對于p38MAPK和CREB信號通路的影響。 方法：Aβ1-42處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用western blot檢測p38MAPK和CREB的磷酸化水平。進而通過轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，增加AD細胞模型中EphB2的表達水平，觀察EphB2對于p38MAPK和CREB磷酸化水平的影響。 結(jié)果： 1與對照組（Con）相比，p38MAPK磷酸化水平在Aβ1-42處理組（Aβ）顯著升高（P＜0.01），轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）和單獨轉(zhuǎn)染EphB2組（EphB2）與對照組間無顯著性差異。與Aβ1-42處理組（Aβ）相比，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）的p38MAPK磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒后Aβ1-42處理組（iEphB2+Aβ）與Aβ1-42處理組（Aβ）間無顯著性差異。 2與對照組（Con）相比，CREB磷酸化水平在Aβ1-42處理組（Aβ）顯著降低（P＜0.01），轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）和單獨轉(zhuǎn)染EphB2組（EphB2）與對照組間無顯著性差異。與Aβ1-42處理組（Aβ）相比，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組（EphB2+Aβ）的CREB磷酸化水平顯著升高（P＜0.01），轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒后Aβ1-42處理組（iEphB2+Aβ）與Aβ1-42處理組（Aβ）間無顯著性差異。 結(jié)論： Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，p38MAPK磷酸化水平顯著升高，而CREB的磷酸化水平顯著降低。過表達EphB2能夠抑制Aβ1-42誘導的p38MAPK磷酸化水平的升高和CREB磷酸化水平的降低。 綜上所述，本實驗以Aβ1-42處理原代海馬神經(jīng)元建立AD細胞模型，應(yīng)用形態(tài)學、MTT、LDH釋放率、免疫細胞化學、western blot等方法，研究EphB2對于Aβ1-42神經(jīng)毒性的保護作用及其可能機制。研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42對于海馬神經(jīng)元具有時間依賴性的神經(jīng)毒性作用，并導致EphB2表達水平的降低。在海馬神經(jīng)元內(nèi)過表達EphB2能夠抑制Aβ1-42對海馬神經(jīng)元的毒性損傷，且在Aβ1-42處理1h的時候，EphB2的保護作用最為顯著，因此，本實驗采用Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元1h的模型來研究EphB2的作用機制。Aβ1-42誘導海馬神經(jīng)元內(nèi)NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達顯著下降，過表達EphB2能夠抑制Aβ1-42誘導的NR1和NR2B在突觸表達的降低，提示在Aβ1-42誘導的毒性損傷模型中，EphB2具有調(diào)節(jié)NMDAR在突觸表達的功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42誘導的p38MAPK的磷酸化升高以及CREB磷酸化的降低，，都能夠通過增加EphB2的表達水平而得以恢復�？傊�，本研究結(jié)果提示EphB2通過提高NMDAR在突觸的表達水平，進而促進突觸NMDAR下游信號通路p38MAPK和CREB的激活而對Aβ1-42誘導的神經(jīng)毒性起到保護作用，初步揭示了EphB2神經(jīng)保護作用的分子機制，為AD的治療提供了新的思路和方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749.1

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王云甫!442000,余紹祖,范華燕!442000,任傳成!442000,何國厚!442000,葉天雄!442000;局灶性腦缺血后海馬各區(qū)NMDAR表達的實驗研究[J];臨床神經(jīng)病學雜志;2001年01期

2 郁毅剛,徐如祥,姜曉丹,柯以銓,蔡穎謙;神經(jīng)元膜NMDA受體蛋白免疫復合物單分子納米結(jié)構(gòu)及定位AFM比較研究(英文)[J];中國神經(jīng)科學雜志;2005年02期

3 李淑慧,胡德耀,李曉輝,王正國;N-甲基-D-天門冬氨酸受體與新型鎮(zhèn)痛藥的開發(fā)[J];醫(yī)藥導報;2003年08期

4 田國紅,黃遠桂;迷走神經(jīng)刺激對紅藻氨酸致vN大鼠海馬及齒狀回NMDAR_1的影響[J];中國臨床神經(jīng)科學;1999年01期

5 姚國恩,王景周,陳曼娥;血管性癡呆大鼠認知障礙的NMDAR機制研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2002年12期

6 王靜敏,姜玉武,吳希如;IL-1與NMDAR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)驚厥性損傷的相互作用[J];生理科學進展;2005年02期

7 尚宇;顧佩菲;楊聞宇;周凱泉;趙t

本文編號：1884946