本文選題：八肽膽囊收縮素 + 嗎啡��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：阿片類物質(zhì)的長期應(yīng)用可以導(dǎo)致藥物耐受和成癮。阿片成癮者在形成對藥物依賴的病理性記憶的同時還伴有正常的認知和學(xué)習(xí)記憶的損害�？臻g記憶是一類關(guān)于場景和事件的記憶，急慢性嗎啡作用均可導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)和記憶的損害。八肽膽囊收縮素（Cholecystokinin octopeptide, CCK-8）作為一種目前最強的抗阿片肽類物質(zhì)以多種形式廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，在食物性記憶模型，回避反應(yīng)以及空間識別中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。然而，CCK-8對嗎啡致記憶損害作用及其相關(guān)機制尚未見報道。 已知突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶的生理基礎(chǔ)，而海馬的突觸可塑性改變與空間記憶密切相關(guān)。神經(jīng)細胞骨架系統(tǒng)在神經(jīng)元突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。Tau和MAP-2作為微管相關(guān)蛋白分別定位于軸突和樹突，它們通過影響微管的穩(wěn)定性參與了突觸前、突觸后可塑性以及神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)可塑性的調(diào)節(jié)。以往研究結(jié)果提示tau和MAP-2的表達及磷酸化狀態(tài)與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)。但是，tau和MAP-2是否參與了CCK-8對嗎啡致突觸可塑性改變的影響尚不明確。 因此，本實驗觀察了外源性CCK-8對慢性及急性嗎啡作用小鼠空間記憶的影響，然后，進一步在整體和細胞水平探討了tau和MAP-2在CCK-8調(diào)節(jié)嗎啡致突觸可塑性改變中的作用，，以明確CCK-8改善嗎啡致空間記憶損害的作用機制。 第一部分：CCK-8對嗎啡作用小鼠空間記憶的影響 目的：應(yīng)用Morris水迷宮分別觀察嗎啡依賴和急性嗎啡作用對小鼠空間參考記憶的影響；在嗎啡作用小鼠側(cè)腦室給予不同劑量的CCK-8，以評價外源性CCK-8對嗎啡致空間記憶損害的作用，同時觀測了CCK-8單獨作用對空間參考記憶的作用。 方法：①按照劑量遞增的方式建立小鼠嗎啡依賴模型（第1-6天皮下注射嗎啡劑量分別為20，40，60，80，100，100mg/kg，每天2次，間隔12小時），或者側(cè)腦室注射不同劑量（0.001，0.01，0.1和1μg）的CCK-8每天2次，間隔12小時，在接下來的7天進行Morris水迷宮的適應(yīng)、訓(xùn)練和測試，訓(xùn)練和測試均在藥物注射后30分鐘進行。在此期間小鼠繼續(xù)每天2次進行皮下注射100mg/kg嗎啡或者側(cè)腦室注射CCK-8，以觀測慢性嗎啡和外源CCK-8單獨作用對小鼠空間參考記憶的影響；在每次皮下注射嗎啡前30分鐘予側(cè)腦室給予不同劑量（0.001，0.01，0.1和1μg）的CCK-8以觀測外源性CCK-8對慢性嗎啡致空間參考記憶損害的作用。②應(yīng)用2天Morris水迷宮模型，分別在第一天訓(xùn)練前以及第二天測試前30分鐘腹腔注射1，5，10mg/kg的嗎啡或者側(cè)腦室注射CCK-8（0.001，0.01，0.1和1μg）以觀測急性嗎啡和外源性CCK-8單獨作用對空間參考記憶獲得和再現(xiàn)的影響；分別在嗎啡前或者嗎啡后給予不同劑量的CCK-8（0.001，0.01，0.1和1μg）以觀測外源性CCK-8對急性嗎啡損害空間參考記憶獲得的作用。 結(jié)果：①本部分實驗共使用552小鼠用于最終的統(tǒng)計學(xué)分析。 ②慢性嗎啡處理明顯降低了小鼠在空間探索實驗中的成績，但是并不影響小鼠在定向航行實驗中的表現(xiàn)，并且慢性嗎啡作用對空間記憶的損害可以延遲至嗎啡自發(fā)戒斷后7天；相對于生理鹽水對照組，單獨給予CCK-8（0.1和1μg）組小鼠在定向航行實驗和空間探索實驗的成績均有明顯的提高；CCK-8（0.01，0.1和1μg）+嗎啡組在定向航行實驗和空間探索實驗的成績較嗎啡組明顯提高。 ③訓(xùn)練前腹腔注射嗎啡（5和10mg/kg）明顯損害小鼠在定向航行實驗和空間探索實驗的表現(xiàn)，但是測試前腹腔注射嗎啡（1，5和10mg/kg）對小鼠在水迷宮中的表現(xiàn)無明顯影響；訓(xùn)練前側(cè)腦室注射CCK-8（0.01，0.1和1μg）以及測試前注射CCK-8（0.1和1μg）均可提高小鼠在定向航行實驗和空間探索實驗中的成績；訓(xùn)練前和測試前給予CCK-8（0.1和1μg）均可明顯減輕嗎啡（10mg/kg）對小鼠空間參考記憶獲得的影響，但是CCK-8（0.001和0.01μg）卻無明顯的作用。 小結(jié)：①慢性嗎啡作用明顯損害了小鼠的空間參考記憶，并且這種損害作用可以延遲至嗎啡停藥后7天；側(cè)腦室預(yù)給予CCK-8可改善慢性嗎啡誘導(dǎo)的空間參考記憶損害，并且CCK-8單獨作用也可明顯促進小鼠的空間參考記憶；②急性嗎啡作用明顯影響了小鼠空間參考記憶的獲得，但不損害空間參考記憶的再現(xiàn)；訓(xùn)練前和測試前給予CCK-8均可明顯改善嗎啡致空間參考記憶獲得的損害；訓(xùn)練前或測試前單獨給予CCK-8可分別促進小鼠空間參考記憶的獲得和再現(xiàn)，且呈劑量依賴性。 第二部分：CCK-8減輕嗎啡致空間記憶損害的機制研究1CCK-8對嗎啡作用小鼠海馬乙酰膽堿含量以及樹突棘密度的影響 目的：通過觀測外源性CCK-8對急慢性嗎啡作用小鼠海馬乙酰膽堿含量以及樹突棘密度的影響，明確CCK-8減輕嗎啡致空間記憶損害的突觸可塑性機制。 方法：建立急慢性嗎啡作用動物模型，應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及高爾基染色觀察乙酰膽堿的含量以及樹突棘密度。 結(jié)果：本部分實驗共有48只小鼠用于統(tǒng)計學(xué)分析。CCK-8（1μg）預(yù)處理可明顯翻轉(zhuǎn)急性嗎啡作用后海馬乙酰膽堿含量的降低；CCK-8（1μg）急性作用可使海馬乙酰膽堿遞質(zhì)含量明顯升高；慢性嗎啡或CCK-8單獨作用均可明顯增加海馬乙酰膽堿的含量，但CCK-8（1μg）預(yù)處理并不影響嗎啡作用。CCK-8（1μg）預(yù)處理可明顯抑制慢性嗎啡作用后海馬CA1區(qū)的樹突棘密度的降低；慢性CCK-8單獨作用可明顯升高海馬CA1區(qū)的樹突棘密度。2CCK-8對嗎啡作用小鼠海馬tau和MAP-2表達的影響 目的：通過觀測海馬微管相關(guān)蛋白tau和MAP-2表達的改變，探討骨架蛋白系統(tǒng)在CCK-8對嗎啡致突觸可塑性改變中的作用。 方法：應(yīng)用RT-PCR以及Western Blot檢測海馬組織tau和MAP-2的mRNA及蛋白表達。 結(jié)果：本部分實驗共有48只小鼠用于統(tǒng)計學(xué)分析。急性嗎啡或CCK-8單獨作用均不影響海馬tau和MAP-2的表達， CCK-8（1μg）預(yù)處理可明顯抑制急性嗎啡作用后tau Ser396以及MAP-2Ser136、Thr1620/1623位點磷酸化的增加；而tau Ser262位點的磷酸化水平在急性嗎啡作用后無明顯變化，在CCK-8急性作用后明顯增高。 CCK-8（1μg）預(yù)處理可明顯翻轉(zhuǎn)慢性嗎啡作用后海馬tau和MAP-2表達的降低，而慢性CCK-8單獨作用僅可上調(diào)MAP-2的表達，對tau的表達無明顯作用；CCK-8（1μg）預(yù)處理明顯抑制了慢性嗎啡誘導(dǎo)tauSer262和Ser396以及MAP-2Ser136和Thr1620/1623位點磷酸化水平的上調(diào)；CCK-8（1μg）慢性作用也可抑制tau和MAP-2在各位點的磷酸化。3CCK-8對嗎啡誘導(dǎo)tau和MAP-2磷酸化改變的機制研究 目的：在建立嗎啡急、慢性作用細胞模型的基礎(chǔ)上，觀察外源性CCK-8對嗎啡誘導(dǎo)tau和MAP-2磷酸化相關(guān)激酶以及磷酸化酶的作用，初步探討CCK-8影響嗎啡誘導(dǎo)tau和MAP-2磷酸化的具體機制。 方法：建立嗎啡急性和慢性作用細胞模型，應(yīng)用Western Blot以及酶活性試劑盒檢測tau和MAP-2磷酸化以及PKA，GSK-3β以及PP2A的活性。 結(jié)果：SH-SY5Y細胞的cAMP水平在嗎啡作用3小時以內(nèi)降低，而在24小時以后明顯上調(diào)；100M嗎啡作用48小時后，應(yīng)用10M納洛酮進行催促戒斷后cAMP水平明顯上調(diào)。因此，分別以100M嗎啡作用SH-SY5Y細胞30分鐘以及48小時作為急慢性嗎啡細胞模型。 與動物實驗結(jié)果一致，CCK-8可明顯抑制急慢性嗎啡作用后tau和MAP-2磷酸化水平的上調(diào)；為了明確tau和MAP-2磷酸化的機制，進一步觀察了PKA，GSK-3β以及PP2A活性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述三種酶活性在急性嗎啡作用后明顯下調(diào)，而在慢性嗎啡作用后均明顯上調(diào)；PKA的特異抑制劑H-89可明顯降低慢性嗎啡誘導(dǎo)tau Ser262磷酸化水平的升高，而應(yīng)用GSK-3β特異抑制劑SB216763后tau的Ser396位點以及MAP-2的Ser136和Thr1620/1623位點的磷酸化水平均明顯下降。 10-6M CCK-8干預(yù)可明顯翻轉(zhuǎn)急性嗎啡作用引起的PP2A活性的下降，急性CCK-8單獨作用明顯抑制PKA和GSK-3β的活性，但是對PP2A活性并無明顯影響；CCK-8可明顯抑制慢性嗎啡引起的PKA和GSK-3β活性的增高，同時慢性單獨作用也可明顯降低PKA和GSK-3β的活性。 小結(jié)：外源性CCK-8可通過增加海馬乙酰膽堿含量以及樹突棘密度減輕嗎啡致空間記憶的損害；CCK-8可通過下調(diào)tau和MAP-2的磷酸化水平調(diào)節(jié)嗎啡誘導(dǎo)的突觸可塑性變化。 結(jié)論：本文系統(tǒng)研究了外源性CCK-8對急慢性嗎啡致空間記憶損害的影響以及突觸可塑性機制，在整體和細胞水平觀察了CCK-8對急慢性嗎啡處理后tau和MAP-2表達及磷酸化改變的影響，并探討了tau和MAP-2磷酸化的相關(guān)酶活性機制。得出以下結(jié)論： 1側(cè)腦室給予CCK-8（0.01、0.1、1μg）可明顯減輕嗎啡依賴小鼠空間參考記憶的損害；訓(xùn)練前和測試前給予CCK-8（0.1、1μg）均可明顯減輕急性嗎啡誘導(dǎo)的空間參考記憶獲得的損害。提示大劑量外源性CCK-8可通過自身對學(xué)習(xí)和記憶的影響和/或?qū)Π⑵牡霓卓棺饔脜⑴c了其減輕嗎啡誘導(dǎo)空間記憶損害的過程。 2CCK-8（1μg）可通過增加海馬乙酰膽堿含量以及樹突棘密度減輕嗎啡致空間記憶的損害，且通過下調(diào)tau和MAP-2的磷酸化水平調(diào)節(jié)嗎啡誘導(dǎo)的突觸可塑性變化。 3急性嗎啡作用主要通過抑制PP2A活性上調(diào)tau和MAP-2磷酸化水平，而慢性嗎啡作用則通過增強PKA和GSK-3β活性誘導(dǎo)了tau和MAP-2的磷酸化；急慢性CCK-8單獨作用主要通過抑制PKA和/或GSK-3β活性使tau和MAP-2磷酸化水平下降；CCK-8干預(yù)可通過上調(diào)急性嗎啡作用引起的PP2A活性下降及下調(diào)慢性嗎啡引起的PKA和GSK-3β活性增高，抑制了嗎啡誘導(dǎo)tau和MAP-2磷酸化水平的增高。
[Abstract]:The long - term use of opioids can lead to drug tolerance and addiction , and opiate addicts are accompanied by normal cognitive and learning memory impairment while forming a pathological memory of dependence on drugs . Spatial memory is a kind of impairment of spatial learning and memory due to the memory and acute and chronic morphine effects of the scene and event . Eight - peptide stokinin octopathy ( CCK - 8 ) plays an important role in the memory model , avoidance response and spatial recognition . However , CCK - 8 has not been reported in the memory impairment of morphine and its associated mechanisms .

It is known that synaptic plasticity is a physiological basis for learning and memory , and synaptic plasticity in hippocampus plays an important role in synaptic plasticity . Tau and MAP - 2 act as microtube - related proteins in axon and dendritic cells . These results suggest that the expression and phosphorylation status of tau and MAP - 2 are closely related to learning and memory . However , whether tau and MAP - 2 are involved in CCK - 8 is not clear in the effects of CCK - 8 on synaptic plasticity changes in morphine .

Therefore , the effects of exogenous CCK - 8 on the spatial memory of chronic and acute morphine were observed , and then the effects of tau and MAP - 2 on the synaptic plasticity of morphine induced by CCK - 8 were further discussed at the whole and cellular level , so as to clarify the mechanism of CCK - 8 to improve the effect of CCK - 8 on the spatial memory impairment induced by morphine .

The effect of CCK - 8 on the spatial memory of morphine - induced mice

Objective : To observe the effect of morphine dependence and acute morphine on spatial reference memory in mice by Morris water maze .
CCK - 8 doses of CCK - 8 were administered in the lateral ventricle of morphine - induced mice to evaluate the effect of exogenous CCK - 8 on spatial memory impairment induced by morphine , while CCK - 8 effects on spatial reference memory were observed .

Methods : 鈶

本文編號：1839248