發(fā)布時間：2018-04-14 00:22

  本文選題：牙髓干細胞 + 牙周膜干細胞��； 參考：《中國人民解放軍醫(yī)學院》2016年碩士論文

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是發(fā)生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統(tǒng)退行性病變,其主要臨床表現是記憶力、認知功能、人格及語言功能逐漸下降.AD有兩個典型的組織病理學改變?yōu)槔夏臧?Senile plaque, SP)和神經原纖維纏結(Neurofibrillary tangles, NFT),其中過度磷酸化的微管Tau蛋白于神經元內高度螺旋化是形成NFT的主要原因.目前對于AD的治療方法主要以對癥治療為主,包括藥物治療和非藥物治療用以改善認知功能和控制精神癥狀,減少并發(fā)癥,尚不能有效控制病程發(fā)展、治愈疾病。隨著干細胞轉化醫(yī)學的發(fā)展,已有多種干細胞用于治療AD的研究報道,顯示出良好的效果和臨床應用前景。但探尋更理想的種子細胞,仍然是AD干細胞治療的重要課題.牙髓干細胞(Dental pulp stem cells, DPSCs)和牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是來源于神經嵴的牙源性干細胞,相比于臍帶等中胚層來源的干細胞,具有更加明顯的神經分化潛能,而且,DPSCs和PDLSCs具有可自體取材,免疫原性低等優(yōu)點,在治療神經系統(tǒng)疾病方面更具優(yōu)勢。目前體內和體外許多研究都證實DPSCs和PDLSCs能夠幫助預防和修復神經損傷,而DPSCs在治療帕金森、大腦損傷和脊髓損傷等中樞神經系統(tǒng)疾病方面已取得一定療效,但它們對AD的治療作用研究尚未見報道。本研究通過岡田酸(Okadaic acid, OA)損傷SH-SY5Y神經細胞系,建立AD體外細胞模型,在此基礎上系統(tǒng)研究DPSCs和PDLSCs對AD細胞模型的治療效果,以期為DPSCs與PDLSCs用于AD治療提供理論和實驗依據.研究的主要方法和結果如下：1.分別采用酶消化法和組織塊法原代培養(yǎng)分離人DPSCs、PDLSCs和臍帶間充質干細胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs),單細胞克隆培養(yǎng)純化DPSCs和PDLSCs;倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),CCK-8比較細胞增殖能力,流式細胞儀和免疫熒光染色檢測細胞表面標志物。體外誘導這3種干細胞向成骨、成脂和成軟骨方向分化,通過細胞形態(tài)變化、特異性染色(堿性磷酸酶、茜素紅染色和Von Kossa染色,油紅O染色,阿爾辛藍和HE染色)分別鑒定誘導細胞成骨、成脂、成軟骨分化能力,進一步實時熒光定量PCR檢測比較3種細胞成骨相關基因OCN和RUNX2及成脂相關基因PPAR-γ的表達水平。結果顯示：這3種間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)細胞形態(tài)略有不同,但細胞表面標志蛋白表達相似,均陽性表達CD166、CD105、CD44、CD73和CD90以及間充質細胞標記vimentin和α-SMA;而DPSCs和PDLSCs增殖能力顯著高于UCMSCs;三者均可向成骨、成脂和成軟骨誘導分化,但分化能力不同。成骨分化能力由強至弱依次為DPSCs、UCMSCs、PDLSCs;成脂分化能力DPSCs分化能力最強,UCMSCs次之,PDLSCs相對較弱；成軟骨分化能力比較發(fā)現：與DPSCs相比,UCMSCs和PDLSCs分化能力更強。2.采用倒置相差顯微鏡觀察和CCK-8檢測不同濃度OA溶液與神經細胞系SH-SY5Y孵育24h細胞形態(tài)和細胞活性變化,確定建立細胞模型的最佳給藥濃度。用確定的OA濃度(20nmol/L)孵育SH-SY5Y細胞系24h,建立細胞損傷AD體外模型.再通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、CCK-8檢測細胞活性、Hoechst 33258熒光染色細胞凋亡率、激光共聚焦顯微鏡分析a-tubulin和鬼筆環(huán)肽特染的細胞骨架、透射電鏡觀察細胞微管結構以及蛋白免疫印跡分析細胞Tau蛋白磷酸化水平的變化。結果顯示：篩選確定20nmol/L OA作用24h是建立AD細胞模型適宜的作用濃度和作用時間.從形態(tài)看,20nmol/L OA損傷SH-SY5Y細胞24h后,其細胞表面形態(tài)改變,細胞突觸斷裂消失；同時,細胞活性顯著下降,凋亡率上升；微管、微絲結構明顯改變,表現為樹突退縮消失,微管塌陷疏松,微絲排列紊亂,含量明顯降低,這些變化均與對照組有顯著性差異,蛋白免疫印跡半定量分析結果也顯示OA增強了細胞Ser 396位點磷酸化Tau蛋白水平.通過多角度、多層次觀察分析,結果表明：20nmol/L OA損傷SH-SY5Y細胞24h所建立AD細胞模型是可靠的.3.采用Transwell小室及條件培養(yǎng)基共孵育的方式,分別研究DPSCs和PDLSCs對AD細胞模型的治療作用。實驗通過比較對照組、模型組和治療組細胞形態(tài)、細胞活性、細胞凋亡率、細胞骨架、細胞微管結構及細胞內Tau蛋白磷酸化水平等指標來評價DPSCs和PDLSCs對AD細胞模型的治療效果。研究結果顯示：分別經DPSCs和PDLSCs治療后,OA損傷的細胞形態(tài)逐漸恢復,回縮的樹突重新伸長；細胞數量增多,活性增強；樹突長度、細胞活性及細胞凋亡檢測均顯示治療組與模型組結果有顯著性差異。進一步激光共聚焦發(fā)現：治療組樹突粗壯較長,凋亡細胞少見,核形態(tài)圓而規(guī)則,顯色均勻,類似對照組；α-tubulin、F-actin特染顯示治療組微絲致密規(guī)則,微管纖維變粗,結構與對照組無明顯差異.透射電鏡下可見治療組細胞質內微管結構清晰、排列有序,與對照組相似。同時,蛋白質免疫印跡也發(fā)現治療組細胞Tau蛋白的Ser 396位點磷酸化水平降低。這些結果表明：DPSCs和PDLSCs治療OA損傷所致的AD細胞模型,從細胞形態(tài)、生物活性、微管結構及功能方面均顯示良好的治療效果。綜上所述,本研究的結論是：(1)不同組織來源的MSCs具有不同的生物學特性,牙髓、牙周膜及臍帶間充質干細胞在增殖和三系分化能力上存在差異；(2)20nmol/L OA誘導SH-SY5Y細胞系24h可建立可靠的AD樣細胞模型,用于AD體外研究；(3)DPSCs和PDLSCs對OA誘導的AD細胞模型均有顯著治療作用,其機制與這兩種細胞分泌的多種生長因子可拮抗Tau蛋白磷酸化有關。本研究結果表明DPSCs和PDLSCs作為牙源性MSCs用于治療AD獨具優(yōu)勢,為臨床AD治療提供了新思路、新方法,具有重要的科學價值和廣闊的應用前景.
[Abstract]:Alzheimer ' s disease ( AD ) is a central nervous system degenerative disease characterized by progressive cognitive dysfunction and behavioral impairment . The main clinical manifestations are memory , cognitive function , personality and language function . PDLSCs and mesenchymal stem cells ( UCMSCs ) were cultured and purified to purify DPSCs and PDLSCs . The results showed that these three stem cells differentiated into bone , fat and chondrogenic differentiation . The results showed that the expression of CD166 , CD105 , CD44 , CD73 and CD90 and mesenchymal cells were significantly higher than that of UCMSCs .
The changes of cell morphology and cell activity were determined by reversed phase contrast microscopy and CCK - 8 .
At the same time , the cell activity decreased significantly , and the apoptosis rate increased ;
The effects of DPSCs and PDLSCs on AD cell model were studied by means of multi - angle and multi - level observation .
the number of cells is increased and the activity is enhanced ;
There was significant difference between treatment group and model group by dendritic length , cell activity and apoptosis .
The results showed that : ( 1 ) There were different biological characteristics , dental pulp , periodontal ligament and umbilical cord mesenchymal stem cells in proliferation and three - line differentiation ability .
( 2 ) A reliable AD - like cell model could be established for 24 h of 20nmol / L OA - induced SH - SYY cell line , which could be used in the in vitro study of AD ;
( 3 ) Both DPSCs and PDLSCs have significant therapeutic effects on OA - induced AD cell models , and the mechanisms of these two kinds of growth factors secreted by these two cells are related to Tau protein phosphorylation . The results show that DPSCs and PDLSCs can be used as odontogenic MSCs in the treatment of AD alone , which provides new ideas and methods for clinical AD treatment , and has important scientific value and wide application prospect .

【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
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本文編號：1746890