本文選題：腦缺血　切入點：甲狀腺激素　出處：《南方醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：研究目的 近年來,血管性認知障礙(Vascular cognitive impairment, VCI)越來越受到人們的重視,血管性癡呆(Vascular dementia, VD)是其中的類型之一,它在老年期癡呆的分類中占一定的比重。缺血性病變尤其是多發(fā)性腦梗塞是VD的主要病理基礎(chǔ),但VD的具體發(fā)病機制還在探索中。據(jù)臨床觀察顯示VD患者存在血清甲狀腺激素(Thyroid hormone, TH)水平異常,而臨床并無甲狀腺功能低下的表現(xiàn),多數(shù)研究認為此現(xiàn)象屬于非甲狀腺疾病綜合征(Nonthyroidal illness syndrome, NTIS)。眾所周知,哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為甲狀腺激素活動的重要靶組織,依賴于甲狀腺激素的供應。在嚙齒類動物腦發(fā)育的關(guān)鍵時期,甲狀腺激素的缺乏可影響神經(jīng)元的遷移,生長,分化,突觸的發(fā)生,髓鞘的形成及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖。既往多項研究已證明腦內(nèi)存在相對獨立的甲狀腺激素代謝系統(tǒng),甲狀腺激素的生物活性很大程度上取決于與細胞核受體結(jié)合的T3的濃度。以前一直認為碘化甲腺氨酸可以直接擴散到細胞內(nèi),但近30年甲狀腺激素的分子生物學研究表明：甲狀腺激素主要通過甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體進出細胞。有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽1C1(Organic anion transporting polypeptidelCl,OATP1C1),單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白8(Monocarboxylate transporter8, MCT8)是目前被認為是與甲狀腺激素具有高親和力的轉(zhuǎn)運體。本課題組前期研究應用大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎術(shù)(2-vessel occlusion,2VO)制備慢性腦缺血動物模型,發(fā)現(xiàn)2V05周大鼠可發(fā)生中樞甲狀腺激素水平的異常并同時伴有認知障礙,補充外源性甲狀腺激素的慢性腦缺血大鼠的水迷宮成績明顯改善,提示慢性腦缺血大鼠的學習記憶障礙與中樞甲狀腺激素水平下降有關(guān),但2VO大鼠中樞甲狀腺激素水平下降是否受甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體OATP1C1與MCT8的調(diào)控尚無研究報道。因此本實驗觀察OATP1C1與MCT8在正常大鼠腦組織中的表達并探討它們在2VO術(shù)后不同缺血時間點基因與蛋白水平的變化規(guī)律。 研究方法 1.實驗分組：30只清潔級成年雄性SD大鼠,隨機選擇其中5只正常大鼠用于免疫熒光,其余25只正常大鼠隨機分為正常對照組(normal, n=5),2VO3天組(A,n=5),2V02周組(B,n=5),2V05周組(C,n=5),2V08周組(D,n=5)。 2.采用免疫熒光法觀察OATP1C1, MCT8在正常大鼠側(cè)腦室中的表達。 3.各組大鼠于實驗終點采用熒光定量PCR法(Real-time Quantitative PCR)測定腦組織中TH轉(zhuǎn)運體OATP1C1mRNA和MCT8mRNA的表達水平。 4.各組大鼠于實驗終點采用免疫印跡法(Western blotting)測定腦組織中TH轉(zhuǎn)運體OATP1C1和MCT8的蛋白表達水平。 5.數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。用均數(shù)±標準差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析,組間多重比較采用Dunnetts3法,以P0.05為差異顯著性檢驗界限。 研究結(jié)果 1.免疫熒光法觀察到OATP1C1, MCT8在正常大鼠側(cè)腦室的血管內(nèi)皮細胞膜上表達豐富。 2.與正常組相比較,甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體OATP1C1mRNA水平在2V03天組,2V02周組及2V08周組差異無統(tǒng)計學差異(P=I.000,P=0.604,P=0.448),在2V05周組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)；與2V03天組比較,OATP1C1mRNA水平在2V02周組及2V08周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.456,P=0.427),在2V05周組有統(tǒng)計學差異(P=0.012)；與2V02周組比較,OATP1C1mRNA水平在2V05周組有統(tǒng)計學意義(P=0.013),在2V08周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.718)；與2V05周組比較,OATP1C1mRNA水平在2V08周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.414)。 3.與正常組相比較,甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體MCT8mRNA水平在2V03天組,2V02周組及2V08周組差異無統(tǒng)計學差異(P=I.000,P=0.984,P=0.052),在2V05周組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.046)；與2V03天組比較,MCT8mRNA水平在2V02周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.883),在2V05周及2V08周組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.042,P=0.031)；與2V02周組比較,MCT8mRNA水平在2V05周組沒有統(tǒng)計學意義(P=0.054),在2V08周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.351)；與2V05周組比較,MCT8mRNA水平在2V08周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.135) 4.免疫印跡法檢測所示在2V02周組,2V05周組,2V08周組條帶均較正常組與2V03天組加深,這表明2VO術(shù)后隨著大鼠腦組織缺血時間的延長,甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體OATP1C1和MCT8蛋白在腦組織中的表達增加。 研究結(jié)論 眾所周知甲狀腺激素的生物活性是由細胞內(nèi)的T3濃度決定的,近年來研究發(fā)現(xiàn)T3進入中樞神經(jīng)元有兩種途徑,一種是：1)T4在OATP1C1的參與下通過血腦屏障；2)T4通過不知名的運載體進入神經(jīng)膠質(zhì)細胞；3)T4在D2脫碘酶的作用下轉(zhuǎn)化為T3；4)T3通過不知名的運載體從神經(jīng)膠質(zhì)細胞中被釋放；5)T3被運載體MCT8或另一種載體轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元。另一種途徑是：1)T3由轉(zhuǎn)運體MCT8轉(zhuǎn)運通過血腦屏障,再經(jīng)過MCT8或另一種載體攝取至神經(jīng)元。人類SLCO1C1基因編碼OATP1C1蛋白,OATP1C1蛋白包含712個氨基酸,有12個跨膜區(qū),OATP1C1主要表達在腦組織的血腦屏障和脈絡(luò)從,主要轉(zhuǎn)運T4、rT3和極少量的T3,與T4有高度的特異性,它是T4進入腦組織的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運體,其種屬間有顯著差異,大鼠、小鼠的表達高于人類。人類MCT8(SLC16A2)基因位于Xql3.2包括6個外顯子和5個內(nèi)含子。成熟的mRNA長約4.4kb,包含2個翻譯起始位點(TLSs)。由于TLS不同,人類MCT8基因編碼的蛋白有兩種：種含有613個氨基酸,另一種是含有539個氨基酸。非靈長類MCT8基因缺乏第1位TLS,但第二位與人類同源。MCT8有12個跨膜區(qū),其N端和C端都位于細胞內(nèi)。N端富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基(簡稱PEST),539個氨基酸的蛋白N端含有1個PEST;613個氨基酸的蛋白N端含有2個PEST。因此MCT8也稱為X連鎖含有PEST的轉(zhuǎn)運體(X-linked PEST-containing transporter. XPCT)。MCT8在不同種屬、不同組織中廣泛分布,如腦、心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、甲狀腺、胎盤。MCT8基因突變導致的AHDS綜合征(Allan-Herndon-Dudley syndrome)一類伴有血清T3水平升高的X連鎖精神運動性遲緩綜合癥——使得MCT8在腦發(fā)育中的作用日益受到重視。目前認為甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體MCT8是最具特異性的T3轉(zhuǎn)運體。本實驗采用免疫熒光法觀察到中樞甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體OATP1C1,MCT8均豐富地表達于正常大鼠大腦側(cè)腦室的毛細血管內(nèi)皮細胞膜上,這與之前的研究一致。OATP1C1與MCT8在成年大鼠脈絡(luò)叢中的高度表達,提示它們在血腦屏障或血腦脊液屏障轉(zhuǎn)運甲狀腺激素中發(fā)揮著重要作用。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血(2V05周)成年大鼠發(fā)生認知障礙,同時腦組織T3、T4濃度下降,而在急性期及慢性期補充外源性甲狀腺激素的2VO大鼠學習記憶能力均明顯改善,提示慢性腦缺血大鼠的學習記憶障礙與中樞甲狀腺激素水平下降有關(guān),但是2VO大鼠中樞甲狀腺激素水平下降是否受甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體OATP1C1與MCT8的調(diào)控尚無研究報道,本實驗采用熒光定量PCR法檢測OATP1C1與MCT8在不同缺血時間點的大鼠大腦中基因水平的表達,發(fā)現(xiàn)隨著缺血時間的延長OATP1C1, MCT8基因水平呈不同程度的代償性增加的趨勢,并在缺血5周時達高峰,這表明大鼠在腦缺血5周時腦組織對甲狀腺激素的需求顯著增加,與我們前期觀察到的2V05周大鼠腦組織T3、T4濃度下降相對應,說明OATP1C1與MCT8在轉(zhuǎn)運甲狀腺激素通過血腦屏障及血脈絡(luò)叢屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)、及時補充及代償中樞缺失的甲狀腺激素方面發(fā)揮著非常重要的作用。本實驗采用Western blotting法檢測OATP1C1與MCT8在在不同缺血時間點的大鼠大腦中蛋白水平的表達,發(fā)現(xiàn)隨著缺血時間的延長OATP1C1與MCT8蛋白水平呈不同程度的代償性增加的趨勢,此結(jié)果與基因水平的變化基本一致。 盡管隨著缺血時間的延長OATP1C1與MCT8基因水平與蛋白呈不同程度的代償性增加的趨勢,但依然不足以代償缺血大鼠腦組織中減少的甲狀腺激素,原因可能有以下幾點：1.隨著腦組織缺血時間的延長,大鼠的血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)和脈絡(luò)膜-腦脊液屏障(Choroid Plexus-Cerebrospinal fluid barrier, CP-CSFB)產(chǎn)生不同程度的損傷,因而影響B(tài)BB和CP-CSFB上皮細胞內(nèi)的OATP1C1與MCT8的代償能力；2.是否腦缺血時中樞神經(jīng)系統(tǒng)甲狀腺激素的代謝過程還存在著其它環(huán)節(jié)的異常,這有待更進一步的研究。 總之,從本實驗中,我們看到,中樞甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體OATP1C1,MCT8都豐富地表達于大腦側(cè)腦室脈絡(luò)叢的毛細血管內(nèi)皮細胞膜上,這提示它們在血腦屏障或血腦脊液屏障轉(zhuǎn)運甲狀腺激素中發(fā)揮著重要作用。隨著缺血時間的延長OATP1C1與MCT8基因水平與蛋白呈不同程度的代償性增加的趨勢,雖然不足以代償缺血大鼠腦組織對甲狀腺激素的需求,但是間接反映了腦缺血后腦組織T3,T4水平下降,因而腦缺血大鼠腦組織對TH轉(zhuǎn)運體的需求增加。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R749.13

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 劉俊馳,劉薇薇,杜素君;非甲狀腺疾病中的甲狀腺激素水平研究[J];標記免疫分析與臨床;2004年01期

2 李露斯,劉之榮,肖桃元;大鼠慢性腦血流灌注不足腦的病理組織學和超微結(jié)構(gòu)變化[J];第三軍醫(yī)大學學報;1999年11期

3 袁大華;王群;;NTIS大鼠血清及腦組織甲狀腺激素水平及其轉(zhuǎn)運蛋白OATP1C1和MCT8 mRNA變化[J];第三軍醫(yī)大學學報;2012年06期

4 王群,李永軍,陸兵勛;甲狀腺激素對慢性腦缺血大鼠認知功能障礙的改善作用[J];第一軍醫(yī)大學學報;2005年01期

5 劉匯波,葉翠飛,李斌,安文林,李林;雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎對大鼠學習記憶功能和海馬組織形態(tài)學的影響[J];基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床;1998年04期

6 商永華;王群;陸兵勛;劉海云;;慢性腦缺血大鼠血清甲狀腺激素與其認知障礙變化的關(guān)系[J];實用老年醫(yī)學;2007年01期

7 劉海云;王群;陸兵勛;;慢性腦缺血大鼠腦組織T4-5’-脫碘酶及甲狀腺激素的變化[J];中國臨床康復;2006年22期

8 王群;李永軍;;慢性缺血性大鼠認知功能障礙與甲狀腺激素及其受體的關(guān)系[J];中華神經(jīng)科雜志;2006年02期

9 王群,高曉,方忠耀;20例腦梗塞腦脊液甲狀腺激素代謝初步研究[J];中國神經(jīng)精神疾病雜志;1996年04期

，

本文編號：1666965