本文選題：T細胞　切入點：AD動物模型　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)又稱老年性癡呆癥,是好發(fā)于中老年人的一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,為最常見的癡呆類型。隨著人口老齡化進程的加快,老年性癡呆發(fā)病率也逐年升高,其居高不下的致死率及致殘率給患者、家庭和社會造成嚴重的心理和經(jīng)濟負擔(dān)。如何防治這一類疾病已成為當今醫(yī)學(xué)科學(xué)重點研究的課題之一。 老年性癡呆在病理上以神經(jīng)細胞外存在老年斑(senile plaque, SP)、細胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibillary tangle, NFT)、皮層神經(jīng)元減少以及新皮層和腦膜血管出現(xiàn)淀粉樣變等為特征。在臨床上老年性癡呆以隱襲起病、緩慢進展、逐漸加重,尤其以記憶力的減退和喪失、語言和行為障礙、思維能力下降以及認知功能障礙等為主要臨床特征。目前,“Aβ假說”被廣泛地接受為老年性癡呆最主要的發(fā)病機理之一。該假說認為Aβ聚集和沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié),多種病因引起β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein)代謝異常,表現(xiàn)為Aβ產(chǎn)生過多或降解減少,Aβ在特定腦區(qū)聚集沉淀,引發(fā)各種免疫炎癥反應(yīng)和神經(jīng)毒性級聯(lián)反應(yīng),造成突觸損傷和神經(jīng)元死亡,從而導(dǎo)致老年性癡呆患者的記憶力減退和認知功能障礙等癥狀產(chǎn)生。 雖然AD不被認為是經(jīng)典的炎癥或免疫反應(yīng)介導(dǎo)的疾病,但大量的實驗證據(jù)和臨床資料證明老年性癡呆的發(fā)生與機體免疫功能的異常之間有著密切的關(guān)系。當Aβ清除機制受損,致使Aβ沉積形成免疫原,激活了機體免疫反應(yīng)。研究證實在AD患者腦內(nèi)有強烈的炎癥反應(yīng)發(fā)生,有資料顯示AD動物模型和AD患者的體液免疫及細胞免疫功能均有異常,Aβ實驗性免疫治療的功效進一步證實了AD發(fā)病的免疫炎癥機理,主動免疫不僅產(chǎn)生了特異性抗Aβ抗體,阻止和減少了淀粉樣斑塊的形成,而且還減輕了AD的臨床癥狀、提高了接種鼠的認知能力。但是少數(shù)病人在接種疫苗后出現(xiàn)了腦膜腦炎等副作用,在后來的尸檢中還發(fā)現(xiàn)患者腦膜中有大量自身反應(yīng)性T細胞和巨噬細胞浸潤現(xiàn)象等。 AD發(fā)病的免疫炎癥機制和Aβ免疫治療的效果啟發(fā)我們思考：既然由Aβ沉積引發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)參與了AD的發(fā)病過程,那么細胞免疫在AD病理中發(fā)揮了何種功能?特別是T細胞在AD病理過程中有何作用?AD的最終病理結(jié)局是腦神經(jīng)元凋亡或死亡而減少,那么T細胞的存在與否對腦神經(jīng)元凋亡和新生是否影響?如有影響其發(fā)揮作用的機制可能是什么?目前,T細胞在老年性癡呆中對神經(jīng)元凋亡和再生的影響還沒有直接證據(jù),其機制也不清楚。本課題將對以上問題開展初步研究,為揭示AD的發(fā)病機制而進行基礎(chǔ)性的研究和探索。 目的： 為探究T細胞在阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)發(fā)病機理中對腦海馬神經(jīng)元凋亡和再生的影響及其分子機制。 1.建立模擬AD的BALB/c小鼠動物模型。包括免疫功能正常的模擬AD小鼠動物模型和T細胞免疫缺陷的模擬AD小鼠動物模型,并對這種新建立的動物模型進行病理學(xué)評價。 2.利用所建立模擬AD的BALB/c小鼠動物模型,探討T淋巴細胞在AD模型鼠中對小鼠腦海馬神經(jīng)元凋亡和再生的影響作用。 3.應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù),探究在AD模型鼠中T細胞對海馬神經(jīng)元凋亡和再生影響的可能分子機制。 方法： 1.選取BALB/c正常小鼠(BALB/c-WT)和T細胞缺陷的BALB/c裸小鼠(BALB/c-nude)各24只,隨機分為實驗組和對照組。利用顯微注射方法分別在實驗組和對照組小鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射寡聚態(tài)Aβ1-42和生理鹽水(NS)。實驗組又分為兩組,即實驗I組(BALB/c-WT+Ap1-42)和實驗II組(BALB/c-nude+Ap1-42),對照組也分對照I組(BALB/c-WT+NS)和對照II組(BALB/c-nude+NS),每組12只,4組共48只。建立模擬AD的BALB/c小鼠動物模型。于造模后的第7d、21d二個時間點分批次分別取各組模型鼠的腦組織和外周血。 2.HE染色,在光鏡下觀察并比較實驗組(Aβ1-42-injection)與對照組(NS-injection)注射部位的腦組織及周圍的炎癥反應(yīng)情況；免疫組織化學(xué)顯色檢測Aβ1-42在實驗組小鼠腦內(nèi)沉積表現(xiàn)。 3.利用免疫組織化學(xué)方法,于造模21d時,分別檢測實驗組和對照組小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)與凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達情況；用TUNEL法進一步檢測各組小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡的情況。 4.采用同樣方法,于造模7d時,用微管結(jié)合蛋白(Doublecortin, DCX)抗體特異性標記海馬齒狀回增殖的神經(jīng)前體細胞,分別檢測實驗組和對照組小鼠腦海馬神經(jīng)前體細胞再生的情況。 5.用熒光定量RT-PCR方法,分別檢測并比較造模后的第7d和21d實驗組與對照組小鼠外周血中的IL-2、 IFN-γ的基因表達和腦組織IL-1β和TNF-α的基因表達情況。 6.應(yīng)用Image pro-plus6.0圖像分析系統(tǒng)軟件,分別將各組測量所得的DCX、Bcl-2、Bax和TUNEL法標記的陽性產(chǎn)物平均光密度值,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件,將數(shù)據(jù)分別進行單因素方差分析(One-way ANOVA),進行組間多重比較；將熒光定量RT-PCR檢測所得的基因表達數(shù)據(jù)作重復(fù)測量方差分析,不同時間兩組比較用t檢驗；均以P0.05,認為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.通過HE染色,7d時在光鏡下可以觀察到注射Aβ1-42部位的腦組織周圍出現(xiàn)明顯的神經(jīng)毒性表現(xiàn)。實驗組(Aβ1-42-injection)與對照組(NS-injection)相比,實驗組腦組織炎癥損傷范圍擴大,炎癥損傷區(qū)及周圍神經(jīng)元有變性死亡情況出現(xiàn)。免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示,在實驗組小鼠腦內(nèi)有Aβ1-42陽性產(chǎn)物存在,而對照組小鼠腦內(nèi)無Aβ1-42陽性產(chǎn)物出現(xiàn)。 2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：造模21d時,各組間Bcl-2的蛋白表達有差別(F=368.159,P=0.000)。其中正常小鼠(BALB/c-WT)與裸小鼠(BALB/c-nude)相比,其海馬區(qū)抑凋亡基因Bcl-2的蛋白表達較強,二者之間有顯著性差異(P0.01),說明T細胞的存在能促進Bcl-2基因的蛋白表達而抑制凋亡發(fā)生。各組間Bax蛋白表達也有差別(Welch F=89.723,P=0.000),裸小鼠(BALB/c-nude)與正常小鼠(BALB/c-WT)相比,其海馬區(qū)促凋亡基因Bax的蛋白表達強,二者之間也有顯著性差異(P0.01),提示T細胞缺乏可能促進Bax基因的蛋白表達而促進凋亡的發(fā)生。TUNEL檢測凋亡的結(jié)果也顯示,各組間有差別(WelchF=293.549,P=0.000),當T細胞正常時海馬神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象減少；當T細胞缺乏時海馬神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象增加。實驗結(jié)果還顯示,實驗組(Aβ1-42注射組)和對照組(NS注射組)相比,小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象明顯增強,提示注射Aβ1-42可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的損傷而引起神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。 3.神經(jīng)元微管結(jié)合蛋白(Doublecortin, DCX)能特異性標記增殖的神經(jīng)元前體細胞。造模7d時各組間DCX表達有差別(F=460.707,P=0.000)。在實驗組(Aβ1-42-injection)和對照組(NS-injection)組小鼠海馬齒狀回的顆粒細胞下層(SGZ)均可見到數(shù)量不等的DCX標記的陽性細胞,DCX陽性細胞形態(tài)典型,突起明顯,主要集中在海馬齒狀回的顆粒細胞下層(SGZ)。正常小鼠(BALB/c-WT)的陽性細胞數(shù)量多于裸小鼠(BALB/c-nude),統(tǒng)計結(jié)果顯示：實驗I組和對照I組與實驗II組相比、實驗II組與對照II組相比,均有顯著性差異(P0.01)。結(jié)果提示T細胞的存在對神經(jīng)元的再生有促進作用,這就比較直接地證明了T細胞在神經(jīng)元再生方面有一定的促進作用。而在相同小鼠中,實驗組(Ap1-42-injection)與對照組(NS-injection)相比,海馬齒狀回顆粒細胞下層(SGZ)的DCX陽性細胞明顯減少,提示Aβ1-42的神經(jīng)毒性對腦海馬神經(jīng)元再生有抑制作用。 4.熒光定量PCR檢測外周血和腦組織中相關(guān)細胞因子的基因表達結(jié)果各組間相關(guān)細胞因子的基因表達均有差別(P=0.000)。在外周血中,正常小鼠(Balb/c-WT)與裸小鼠(Balb/c-Nude)相比,實驗組和對照組的IL-2、IFN-γ基因表達在7d和21d兩個時間點均增加,有顯著性差異(P0.01)。隨著時間增加,正常小鼠(Balb/c-WT)IL-2基因表達均下調(diào)(P0.01)；裸小鼠在實驗組和對照組IL-2基因表達變化不一致；實驗組小鼠(Aβ-injection) IFN-γ基因表達有明顯下調(diào)(P0.01)；而對照組(NS-injection)外周血中的IFN-γ基因表達變化不明顯。 在腦組織中,正常小鼠(Balb/c-WT)與裸小鼠(Balb/c-Nude)相比, IL-1β基因表達在7d、21d兩個時間點均增加,其中實驗組與對照組相比IL-1β表達增加顯著(P0.01)；隨著時間變化,正常小鼠(Balb/c-WT)腦組織中的IL-1β基因表達變化有差異性(P0.01)；而裸小鼠(Balb/c-Nude)隨著時間變化,IL-1p基因表達變化無差異性(P0.05)。正常小鼠(Balb/c-WT)與裸小鼠(Balb/c-Nude)相比,7d時實驗組和對照組的TNF-α基因表達增加(P0.01),21d時實驗組TNF-α基因表達增加而對照組該基因表達變化不明顯。 結(jié)論： 1.利用BALB/c正常小鼠和T細胞免疫缺陷的BALB/c裸小鼠,通過海馬注射Aβ1-42淀粉樣蛋白可以建立模擬AD動物模型。新建立的動物模型在一定程度上模擬出老年性癡呆的主要病理表現(xiàn),如在腦內(nèi)出現(xiàn)Aβ1-42沉積和神經(jīng)毒性炎性反應(yīng)等。 2.在AD模型鼠中,T細胞的存在與海馬神經(jīng)元的凋亡和再生之間有著一定的關(guān)系。正常的T細胞對海馬神經(jīng)元的凋亡有抑制作用,而對海馬神經(jīng)元新生有促進作用；T細胞缺乏能促進海馬神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,抑制海馬神經(jīng)元的新生。另外腦內(nèi)注射Aβ1-42可導(dǎo)致腦海馬神經(jīng)元凋亡增加、新生減少,這可能與Aβ1-42的神經(jīng)毒性作用抑制了海馬神經(jīng)元再生、促進神經(jīng)元凋亡有關(guān)。 3.在AD模型鼠中,T細胞的存在對海馬神經(jīng)元凋亡和再生均具有明顯的影響作用,但這種影響機制是如何實現(xiàn)的目前還不清楚。T細胞與中樞小膠質(zhì)細胞之間可能存在一種近似交叉對話(Cross-talking)的復(fù)雜關(guān)系,這種影響作用可能通過激活外周T細胞和中樞小膠質(zhì)細胞,導(dǎo)致相關(guān)細胞因子如IL-2、 IFN-γ、IL-1β和TNF-α等的表達改變,最終在多種細胞因子共同作用下,來實現(xiàn)對神經(jīng)元凋亡和新生的調(diào)控和影響。 主要創(chuàng)新點： 1.建立了一種新的模擬AD的動物模型。選取BALB/c正常小鼠(BALB/c-WT)和T細胞缺陷的BALB/c裸小鼠(BALB/c-nude),通過顯微注射的方法建立了模擬AD的動物模型,經(jīng)組織學(xué)檢測該模型能模擬出AD主要病理表現(xiàn)。 2.利用該模型進行研究證實：T細胞的存在對小鼠腦海馬神經(jīng)元的凋亡具有抑制作用,對小鼠海馬神經(jīng)元的再生具有促進作用。 3.進一步研究顯示,在AD模型鼠中,T細胞對海馬神經(jīng)元凋亡和再生的影響作用,可能與外周T細胞相關(guān)因子(如IL-2和IFN-γ)以及腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞相關(guān)因子(如IL-1β和TNF-α)的表達改變有關(guān)。 4.本項研究對揭示AD發(fā)病的免疫學(xué)機理和臨床上AD的免疫治療均具有一定的積極意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R749.16

【參考文獻】

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本文編號：1647612