本文選題：T細胞　切入點：AD動物模型　出處：《南方醫(yī)科大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景： 阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)又稱老年性癡呆癥,是好發(fā)于中老年人的一種神經系統(tǒng)退行性疾病,為最常見的癡呆類型。隨著人口老齡化進程的加快,老年性癡呆發(fā)病率也逐年升高,其居高不下的致死率及致殘率給患者、家庭和社會造成嚴重的心理和經濟負擔。如何防治這一類疾病已成為當今醫(yī)學科學重點研究的課題之一。 老年性癡呆在病理上以神經細胞外存在老年斑(senile plaque, SP)、細胞內出現神經原纖維纏結(neurofibillary tangle, NFT)、皮層神經元減少以及新皮層和腦膜血管出現淀粉樣變等為特征。在臨床上老年性癡呆以隱襲起病、緩慢進展、逐漸加重,尤其以記憶力的減退和喪失、語言和行為障礙、思維能力下降以及認知功能障礙等為主要臨床特征。目前,“Aβ假說”被廣泛地接受為老年性癡呆最主要的發(fā)病機理之一。該假說認為Aβ聚集和沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié),多種病因引起β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein)代謝異常,表現為Aβ產生過多或降解減少,Aβ在特定腦區(qū)聚集沉淀,引發(fā)各種免疫炎癥反應和神經毒性級聯反應,造成突觸損傷和神經元死亡,從而導致老年性癡呆患者的記憶力減退和認知功能障礙等癥狀產生。 雖然AD不被認為是經典的炎癥或免疫反應介導的疾病,但大量的實驗證據和臨床資料證明老年性癡呆的發(fā)生與機體免疫功能的異常之間有著密切的關系。當Aβ清除機制受損,致使Aβ沉積形成免疫原,激活了機體免疫反應。研究證實在AD患者腦內有強烈的炎癥反應發(fā)生,有資料顯示AD動物模型和AD患者的體液免疫及細胞免疫功能均有異常,Aβ實驗性免疫治療的功效進一步證實了AD發(fā)病的免疫炎癥機理,主動免疫不僅產生了特異性抗Aβ抗體,阻止和減少了淀粉樣斑塊的形成,而且還減輕了AD的臨床癥狀、提高了接種鼠的認知能力。但是少數病人在接種疫苗后出現了腦膜腦炎等副作用,在后來的尸檢中還發(fā)現患者腦膜中有大量自身反應性T細胞和巨噬細胞浸潤現象等。 AD發(fā)病的免疫炎癥機制和Aβ免疫治療的效果啟發(fā)我們思考：既然由Aβ沉積引發(fā)的免疫炎癥反應參與了AD的發(fā)病過程,那么細胞免疫在AD病理中發(fā)揮了何種功能?特別是T細胞在AD病理過程中有何作用?AD的最終病理結局是腦神經元凋亡或死亡而減少,那么T細胞的存在與否對腦神經元凋亡和新生是否影響?如有影響其發(fā)揮作用的機制可能是什么?目前,T細胞在老年性癡呆中對神經元凋亡和再生的影響還沒有直接證據,其機制也不清楚。本課題將對以上問題開展初步研究,為揭示AD的發(fā)病機制而進行基礎性的研究和探索。 目的： 為探究T細胞在阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)發(fā)病機理中對腦海馬神經元凋亡和再生的影響及其分子機制。 1.建立模擬AD的BALB/c小鼠動物模型。包括免疫功能正常的模擬AD小鼠動物模型和T細胞免疫缺陷的模擬AD小鼠動物模型,并對這種新建立的動物模型進行病理學評價。 2.利用所建立模擬AD的BALB/c小鼠動物模型,探討T淋巴細胞在AD模型鼠中對小鼠腦海馬神經元凋亡和再生的影響作用。 3.應用熒光定量PCR技術,探究在AD模型鼠中T細胞對海馬神經元凋亡和再生影響的可能分子機制。 方法： 1.選取BALB/c正常小鼠(BALB/c-WT)和T細胞缺陷的BALB/c裸小鼠(BALB/c-nude)各24只,隨機分為實驗組和對照組。利用顯微注射方法分別在實驗組和對照組小鼠雙側海馬CA1區(qū)注射寡聚態(tài)Aβ1-42和生理鹽水(NS)。實驗組又分為兩組,即實驗I組(BALB/c-WT+Ap1-42)和實驗II組(BALB/c-nude+Ap1-42),對照組也分對照I組(BALB/c-WT+NS)和對照II組(BALB/c-nude+NS),每組12只,4組共48只。建立模擬AD的BALB/c小鼠動物模型。于造模后的第7d、21d二個時間點分批次分別取各組模型鼠的腦組織和外周血。 2.HE染色,在光鏡下觀察并比較實驗組(Aβ1-42-injection)與對照組(NS-injection)注射部位的腦組織及周圍的炎癥反應情況；免疫組織化學顯色檢測Aβ1-42在實驗組小鼠腦內沉積表現。 3.利用免疫組織化學方法,于造模21d時,分別檢測實驗組和對照組小鼠海馬神經元內與凋亡相關基因Bcl-2和Bax的表達情況；用TUNEL法進一步檢測各組小鼠海馬神經元發(fā)生凋亡的情況。 4.采用同樣方法,于造模7d時,用微管結合蛋白(Doublecortin, DCX)抗體特異性標記海馬齒狀回增殖的神經前體細胞,分別檢測實驗組和對照組小鼠腦海馬神經前體細胞再生的情況。 5.用熒光定量RT-PCR方法,分別檢測并比較造模后的第7d和21d實驗組與對照組小鼠外周血中的IL-2、 IFN-γ的基因表達和腦組織IL-1β和TNF-α的基因表達情況。 6.應用Image pro-plus6.0圖像分析系統(tǒng)軟件,分別將各組測量所得的DCX、Bcl-2、Bax和TUNEL法標記的陽性產物平均光密度值,應用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件,將數據分別進行單因素方差分析(One-way ANOVA),進行組間多重比較；將熒光定量RT-PCR檢測所得的基因表達數據作重復測量方差分析,不同時間兩組比較用t檢驗；均以P0.05,認為結果有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.通過HE染色,7d時在光鏡下可以觀察到注射Aβ1-42部位的腦組織周圍出現明顯的神經毒性表現。實驗組(Aβ1-42-injection)與對照組(NS-injection)相比,實驗組腦組織炎癥損傷范圍擴大,炎癥損傷區(qū)及周圍神經元有變性死亡情況出現。免疫組織化學方法檢測結果顯示,在實驗組小鼠腦內有Aβ1-42陽性產物存在,而對照組小鼠腦內無Aβ1-42陽性產物出現。 2.免疫組織化學染色結果顯示：造模21d時,各組間Bcl-2的蛋白表達有差別(F=368.159,P=0.000)。其中正常小鼠(BALB/c-WT)與裸小鼠(BALB/c-nude)相比,其海馬區(qū)抑凋亡基因Bcl-2的蛋白表達較強,二者之間有顯著性差異(P0.01),說明T細胞的存在能促進Bcl-2基因的蛋白表達而抑制凋亡發(fā)生。各組間Bax蛋白表達也有差別(Welch F=89.723,P=0.000),裸小鼠(BALB/c-nude)與正常小鼠(BALB/c-WT)相比,其海馬區(qū)促凋亡基因Bax的蛋白表達強,二者之間也有顯著性差異(P0.01),提示T細胞缺乏可能促進Bax基因的蛋白表達而促進凋亡的發(fā)生。TUNEL檢測凋亡的結果也顯示,各組間有差別(WelchF=293.549,P=0.000),當T細胞正常時海馬神經元的凋亡現象減少；當T細胞缺乏時海馬神經元的凋亡現象增加。實驗結果還顯示,實驗組(Aβ1-42注射組)和對照組(NS注射組)相比,小鼠海馬區(qū)神經元凋亡現象明顯增強,提示注射Aβ1-42可導致海馬神經元的損傷而引起神經元凋亡的發(fā)生。 3.神經元微管結合蛋白(Doublecortin, DCX)能特異性標記增殖的神經元前體細胞。造模7d時各組間DCX表達有差別(F=460.707,P=0.000)。在實驗組(Aβ1-42-injection)和對照組(NS-injection)組小鼠海馬齒狀回的顆粒細胞下層(SGZ)均可見到數量不等的DCX標記的陽性細胞,DCX陽性細胞形態(tài)典型,突起明顯,主要集中在海馬齒狀回的顆粒細胞下層(SGZ)。正常小鼠(BALB/c-WT)的陽性細胞數量多于裸小鼠(BALB/c-nude),統(tǒng)計結果顯示：實驗I組和對照I組與實驗II組相比、實驗II組與對照II組相比,均有顯著性差異(P0.01)。結果提示T細胞的存在對神經元的再生有促進作用,這就比較直接地證明了T細胞在神經元再生方面有一定的促進作用。而在相同小鼠中,實驗組(Ap1-42-injection)與對照組(NS-injection)相比,海馬齒狀回顆粒細胞下層(SGZ)的DCX陽性細胞明顯減少,提示Aβ1-42的神經毒性對腦海馬神經元再生有抑制作用。 4.熒光定量PCR檢測外周血和腦組織中相關細胞因子的基因表達結果各組間相關細胞因子的基因表達均有差別(P=0.000)。在外周血中,正常小鼠(Balb/c-WT)與裸小鼠(Balb/c-Nude)相比,實驗組和對照組的IL-2、IFN-γ基因表達在7d和21d兩個時間點均增加,有顯著性差異(P0.01)。隨著時間增加,正常小鼠(Balb/c-WT)IL-2基因表達均下調(P0.01)；裸小鼠在實驗組和對照組IL-2基因表達變化不一致；實驗組小鼠(Aβ-injection) IFN-γ基因表達有明顯下調(P0.01)；而對照組(NS-injection)外周血中的IFN-γ基因表達變化不明顯。 在腦組織中,正常小鼠(Balb/c-WT)與裸小鼠(Balb/c-Nude)相比, IL-1β基因表達在7d、21d兩個時間點均增加,其中實驗組與對照組相比IL-1β表達增加顯著(P0.01)；隨著時間變化,正常小鼠(Balb/c-WT)腦組織中的IL-1β基因表達變化有差異性(P0.01)；而裸小鼠(Balb/c-Nude)隨著時間變化,IL-1p基因表達變化無差異性(P0.05)。正常小鼠(Balb/c-WT)與裸小鼠(Balb/c-Nude)相比,7d時實驗組和對照組的TNF-α基因表達增加(P0.01),21d時實驗組TNF-α基因表達增加而對照組該基因表達變化不明顯。 結論： 1.利用BALB/c正常小鼠和T細胞免疫缺陷的BALB/c裸小鼠,通過海馬注射Aβ1-42淀粉樣蛋白可以建立模擬AD動物模型。新建立的動物模型在一定程度上模擬出老年性癡呆的主要病理表現,如在腦內出現Aβ1-42沉積和神經毒性炎性反應等。 2.在AD模型鼠中,T細胞的存在與海馬神經元的凋亡和再生之間有著一定的關系。正常的T細胞對海馬神經元的凋亡有抑制作用,而對海馬神經元新生有促進作用；T細胞缺乏能促進海馬神經元凋亡的發(fā)生,抑制海馬神經元的新生。另外腦內注射Aβ1-42可導致腦海馬神經元凋亡增加、新生減少,這可能與Aβ1-42的神經毒性作用抑制了海馬神經元再生、促進神經元凋亡有關。 3.在AD模型鼠中,T細胞的存在對海馬神經元凋亡和再生均具有明顯的影響作用,但這種影響機制是如何實現的目前還不清楚。T細胞與中樞小膠質細胞之間可能存在一種近似交叉對話(Cross-talking)的復雜關系,這種影響作用可能通過激活外周T細胞和中樞小膠質細胞,導致相關細胞因子如IL-2、 IFN-γ、IL-1β和TNF-α等的表達改變,最終在多種細胞因子共同作用下,來實現對神經元凋亡和新生的調控和影響。 主要創(chuàng)新點： 1.建立了一種新的模擬AD的動物模型。選取BALB/c正常小鼠(BALB/c-WT)和T細胞缺陷的BALB/c裸小鼠(BALB/c-nude),通過顯微注射的方法建立了模擬AD的動物模型,經組織學檢測該模型能模擬出AD主要病理表現。 2.利用該模型進行研究證實：T細胞的存在對小鼠腦海馬神經元的凋亡具有抑制作用,對小鼠海馬神經元的再生具有促進作用。 3.進一步研究顯示,在AD模型鼠中,T細胞對海馬神經元凋亡和再生的影響作用,可能與外周T細胞相關因子(如IL-2和IFN-γ)以及腦內小膠質細胞相關因子(如IL-1β和TNF-α)的表達改變有關。 4.本項研究對揭示AD發(fā)病的免疫學機理和臨床上AD的免疫治療均具有一定的積極意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R749.16

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 呂誠,胡小令,祝高春,萬衛(wèi),石嘉慶;β-淀粉樣蛋白所致模擬老年性癡呆動物模型的建立[J];江西醫(yī)學院學報;2005年01期

2 謝寧;宋琳莉;牛英才;汪淼;計仁軍;代曉光;;老年性癡呆動物模型研究進展及其評價[J];實驗動物與比較醫(yī)學;2006年01期

3 趙波;張新宇;付學鋒;;阿爾茲海默病動物模型的研究進展[J];神經解剖學雜志;2012年01期

4 文彪;葉冰;董青青;黃國鈞;;老年性癡呆動物模型的研究進展[J];實驗動物科學;2009年01期

5 張洪;鮑波;;淺談國內BALB/c小鼠及KM小鼠的基本生物學特性[J];中國實用醫(yī)藥;2010年03期

，

本文編號：1647612