本文選題：FXR1P　切入點(diǎn)：CMAS　出處：《南華大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是常見的遺傳性智力低下疾病之一，99%的患者是由FMR1（智力低下基因1）的5’端非編碼區(qū)的CGG三核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增或其上游的CpG島過度甲基化引起的FMR1的表達(dá)產(chǎn)物FMRP（fragile X mental retardation protein，智力低下蛋白）表達(dá)下降或缺失所致。定位于3q28的智力低下相關(guān)基因FXR1與FMR1屬同一基因家族，編碼的蛋白質(zhì)都具有與蛋白質(zhì)和RNA結(jié)合特性。本課題在本實(shí)驗(yàn)室前期工作已證明FXR1P與CMAS相互作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究FXR1P與CMAS相互作用后的生物學(xué)效應(yīng)。 目的：研究FXR1P與CMAS相互作用后的生物學(xué)效應(yīng)，為闡明FXR1的基因功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1. PCR擴(kuò)增FXR1基因，將其連接到pcDNA3.1(-)載體上，構(gòu)建pcDNA3.1(-)/FXR1重組載體，并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。2.通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/FXR1重組載體至大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和大鼠血管平滑肌細(xì)胞VSMC細(xì)胞，并通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。3. pcDNA3.1(-)/FXR1重組載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞和VSMC細(xì)胞后，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，使用大鼠抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體（GM1）ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)FXR1過表達(dá)引起的神經(jīng)節(jié)苷脂濃度的變化，超微量ATP酶測(cè)試盒檢測(cè)Na+-K+~ATP酶、Ca2+-Mg2+~ATP酶活力的變化，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：1.酶切鑒定和測(cè)序分析顯示pcDNA3.1(-)/FXR1重組載體構(gòu)建成功。2. pcDNA3.1(-)/FXR1重組載體成功轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞和VSMC細(xì)胞，使FXR1在PC12細(xì)胞和VSMC細(xì)胞中過表達(dá)。3. FXR1的過表達(dá)不影響PC12細(xì)胞的形態(tài)，而FXR1過表達(dá)的VSMC細(xì)胞呈不規(guī)則形；FXR1過表達(dá)能顯著提高PC12細(xì)胞GM1的濃度，而不影響VSMC細(xì)胞GM1的濃度；并顯著提高PC12細(xì)胞Na+-K+~ATP酶和Ca2+-Mg2+~ATP酶的活性，而不影響VSMC細(xì)胞Na+-K+~ATP酶和Ca2+-Mg2+~ATP酶的活性；可以顯著降低PC12細(xì)胞的凋亡率，而不影響VSMC細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)論： 1. FXR1基因的過表達(dá)可能通過提高PC12細(xì)胞中與其相互作用的CMAS的活性，進(jìn)而提高細(xì)胞中GM1的濃度，，對(duì)PC12細(xì)胞的生長產(chǎn)生保護(hù)作用。 2. FXR1P調(diào)節(jié)GM1的濃度具有組織特異性，PC12細(xì)胞是其效應(yīng)細(xì)胞之一，在VSMC細(xì)胞中未呈現(xiàn)這種調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:Fragile X syndrome FXS is one of the most common inherited mental retardation. 99% of the patients were amplified by abnormal CGG trinucleotide repeats in the 5 '-terminal noncoding region of FMR1 or its upstream CpG island hypermethylmethyl. The expression of FMRP(fragile X mental retardation protein (FMRP(fragile X mental retardation protein), the expression product of FMR1, was decreased or deleted. FXR1, a gene associated with mental retardation located at 3q28, belonged to the same gene family as FMR1. The encoded proteins have the properties of binding to proteins and RNA. Based on the previous work in our laboratory, we have proved the interaction between FXR1P and CMAS, and further study the biological effects of FXR1P / CMAS interaction. Aim: to study the biological effects of FXR1P and CMAS interaction in order to elucidate the gene function of FXR1. Methods the FXR1 gene was amplified by PCR and ligated into pcDNA3.1 ~ (-1) vector to construct the recombinant pcDNA3.1(-)/FXR1 vector. The recombinant pcDNA3.1(-)/FXR1 vector was transfected into rat adrenal pheochromocytoma PC12 cells and rat vascular smooth muscle cells VSMC cells by Lipofectamine2000. The transfection efficiency was detected by western blot assay. After transfection of pcDNA3.1(-)/FXR1 recombinant vector into PC12 cells and VSMC cells, the morphological changes of the cells were observed. The changes of ganglioside concentration induced by over-expression of FXR1 were detected by rat anti-ganglioside antibody GM1 Elisa kit, the activity of Na -K ATPase Ca 2 mg 2 + ATPase was detected by ultramicro ATP enzyme test box, and apoptosis was detected by flow cytometry (FCM). Results 1. Restriction endonuclease analysis and sequencing analysis showed that pcDNA3.1(-)/FXR1 recombinant vector was successfully constructed. 2.The recombinant vector of pcDNA3.1(-)/FXR1 was successfully transfected into PC12 cells and VSMC cells. The overexpression of FXR1 in PC12 cells and VSMC cells did not affect the morphology of PC12 cells. The overexpression of FXR1 in VSMC cells with irregular FXR1 significantly increased the concentration of GM1 in PC12 cells, but did not affect the concentration of GM1 in VSMC cells, and significantly increased the activities of Na -K ATPase and Ca2 mg 2 + ATPase in PC12 cells. The activity of Na K ATPase and Ca2 mg 2 + ATPase in VSMC cells was not affected, but the apoptosis rate of PC12 cells was significantly decreased, but the apoptosis rate of VSMC cells was not affected. Conclusion:. 1. Overexpression of FXR1 gene may have protective effect on the growth of PC12 cells by increasing the activity of CMAS interacting with it and increasing the concentration of GM1 in PC12 cells. 2. The effect of FXR1P on the concentration of GM1 was found to be one of the effector cells in VSMC cells, but not in VSMC cells.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R749.94

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本文編號(hào)：1628732