本文關(guān)鍵詞： 阿爾茨海默病 β-淀粉樣蛋白 神經(jīng)甾體 水迷宮 學(xué)習(xí)記憶 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 孕酮 TNF-α IL-1β 神經(jīng)保護(hù)　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：阿爾茨海默�。ˋlzheimer’s disease，AD）又稱老年癡呆癥，是老年期癡呆癥最常見的類型。AD臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶障礙，認(rèn)知功能損傷，以及日常生活能力減退，同時可伴有幻覺、妄想、行為紊亂、人格異常等多種精神癥狀和行為障礙。AD常發(fā)生于65歲以上的老年人，發(fā)病率隨年齡增長而迅速增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球以AD為主的癡呆癥患者約有3560萬，并以每年770萬的速度遞增；預(yù)計到2050年，每85人中將有1人罹患此病。因此，對AD進(jìn)行有效的預(yù)防和治療不僅為醫(yī)學(xué)界所重視，同時也倍受全社會的關(guān)注。AD典型病理改變?yōu)榧?xì)胞外β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）過度沉積形成老年斑（senile plaque，SP），胞內(nèi)Tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT），以及彌漫性神經(jīng)元變性、缺失和全腦萎縮。在AD病例中，家族遺傳性病例約占5%，其他絕大部分散發(fā)病例的致病機(jī)理尚不明確。研究認(rèn)為，AD與Aβ過度沉積、Tau蛋白異常修飾、早老素（presenilin，PS）基因突變等有關(guān)。其中，Aβ作為AD發(fā)病始動因子的觀點得到廣泛認(rèn)可，即：淀粉樣蛋白斑塊的主要成分Aβ在AD發(fā)生過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Aβ是淀粉樣蛋白前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)過β-分泌酶（BACE-1）和γ-分泌酶（γ-secretase）順序剪切后的產(chǎn)物。正常情況下，Aβ為可溶解狀態(tài)，不具有毒性；而在病理狀態(tài)下，Aβ聚集形成寡聚體、多聚體、原纖維，進(jìn)一步沉積形成斑塊，產(chǎn)生損傷作用。Aβ產(chǎn)生損傷作用的機(jī)制包括：引起氧化應(yīng)激，引發(fā)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。胞外Aβ過量生成、過度沉積是鄰近膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，神經(jīng)元死亡，進(jìn)而導(dǎo)致AD臨床癥狀的主要原因。因此，減輕Aβ的損傷作用是治療AD的策略之一。 神經(jīng)甾體（neurosteroid）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的甾體類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的總稱，可由神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成，也可由外周腺體合成后通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)甾體在腦組織中的含量高于外周血中的含量。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元合成的神經(jīng)甾體主要包括：孕烯醇酮（pregnenolone，PREG）、孕烯醇酮硫酸酯（pregnenolone sulfate，PREGS）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、脫氫表雄酮硫酸酯（dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS）、孕酮（progesterone，PROG）、別孕烯醇酮（allopregnanolone，ALLO），以及雌二醇（estradiol，E2）等。研究顯示，神經(jīng)甾體具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗焦慮、抗精神分裂癥、改善學(xué)習(xí)記憶，以及神經(jīng)保護(hù)等作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮廣泛作用。研究顯示，神經(jīng)甾體的表達(dá)調(diào)控改變與包括AD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)，AD時神經(jīng)甾體含量及合成代謝酶表達(dá)發(fā)生改變。對AD患者神經(jīng)甾體水平變化的研究多為神經(jīng)甾體水平與AD易患傾向關(guān)系的分析研究，其研究對象多為AD患者外周血、腦脊液或尸腦，研究對象來源有限。AD患者血漿或腦組織中神經(jīng)甾體水平的變化為長時間、多種因素共同作用的結(jié)果，而在AD進(jìn)程中，神經(jīng)甾體含量的變化與學(xué)習(xí)記憶能力受損的關(guān)系尚不明確。 目的：本研究采用單一損傷因素Aβ25-35誘導(dǎo)AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠模型，通過液液萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performanceliquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）方法分析Aβ?lián)p傷大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)（前額葉皮質(zhì)及海馬）中主要神經(jīng)甾體的含量，通過RT-PCR、 Western blot和免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）分析神經(jīng)甾體合成代謝酶的表達(dá)；篩選與學(xué)習(xí)記憶障礙關(guān)系密切的神經(jīng)甾體，觀察其對Aβ?lián)p傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，探討其學(xué)習(xí)記憶保護(hù)作用的機(jī)制。利用原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，進(jìn)一步在細(xì)胞水平研究Aβ25-35對海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響及神經(jīng)甾體孕酮對抗Aβ?lián)p傷的保護(hù)作用。本實驗為神經(jīng)甾體尤其是孕酮在AD等學(xué)習(xí)記憶障礙類疾病中的應(yīng)用提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。 方法： 1Aβ所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠模型的制備 將30只體重210-230g雄性Spague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為3組，分別為：假手術(shù)組、溶劑對照組（假手術(shù)+蒸餾水）、以及Aβ?lián)p傷組，每組10只。Aβ?lián)p傷模型制備方法如下：動物經(jīng)腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀，沿顱骨中線切開皮膚，暴露前囟。參照圖譜海馬CA1區(qū)位置，于前囟后3.5mm，中線左右2.0mm處，開直徑1mm的骨窗，垂直顱骨表面進(jìn)針2.7mm，緩慢注入5μL（2g/L）Aβ25-35溶液，留針10min使注射物充分?jǐn)U散，緩慢撤針，縫合切口。溶劑對照組注入等體積蒸餾水。術(shù)后7天-12天進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測試，觀察大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。行為學(xué)測試結(jié)束后，動物經(jīng)多聚甲醛心臟灌流進(jìn)行預(yù)固定，之后取腦組織，外固定，石蠟包埋，制備病理切片，通過硫堇尼氏體染色進(jìn)行組織病理學(xué)分析。 行為學(xué)測試：術(shù)后7天-12天進(jìn)行Morris水迷宮（the Morris watermaze）行為學(xué)測試。實驗開始前將動物置于行為學(xué)測試房間，使其適應(yīng)環(huán)境1h。行為學(xué)測試于每天14:30開始，室溫25℃，水溫22℃-24℃，動物測試順序保持不變，測試開始象限隨機(jī)選取。Morris水迷宮行為學(xué)測試歷時6天，前5天進(jìn)行定位航行實驗（the navigation trial），每天訓(xùn)練4次。記錄大鼠入水至尋找到隱匿平臺所需的時間，即逃避潛伏期（escapelatency）。第6天進(jìn)行空間探索實驗（the probe trial），撤去平臺，將大鼠從平臺相對的象限面壁放置入水，記錄動物90s內(nèi)穿越平臺區(qū)的次數(shù)（number of platform crossings）以及在平臺所在象限（第四象限）停留的時間百分比（Ⅳ time ratio）等行為學(xué)指標(biāo)。 組織病理學(xué)分析：預(yù)固定的腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定至少48h，石蠟包埋，常規(guī)腦組織切片（5μm），硫堇尼氏體染色觀察海馬組織學(xué)改變。選取相同海馬截面的切片進(jìn)行硫堇尼氏體染色。每張切片隨機(jī)選取CA1區(qū)3個400倍視野，計數(shù)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片海馬各計數(shù)3個區(qū)段取平均數(shù)。 2Aβ?lián)p傷大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)（前額葉皮質(zhì)及海馬）神經(jīng)甾合成代謝的改變 將90只體重210-230g雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為：假手術(shù)組、溶劑對照組、以及Aβ?lián)p傷組，每組30只。動物處理同上。分別于術(shù)后7天及12天斷頭處死每組中的10只動物，迅速取腦，冰浴分離前額葉皮質(zhì)及海馬，-70℃存放，通過HPLC-MS/MS分析神經(jīng)甾體孕烯醇酮、孕酮、別孕烯醇酮、及17β 雌二醇的含量；其余動物于術(shù)后12天取材，每組中的5只動物斷頭處死，迅速取腦，冰浴分離海馬，-70℃存放，通過RT PCR及Western blot分析神經(jīng)甾體合成代謝酶CYP11A1、3β-HSD及aromatase的表達(dá)改變；其余動物經(jīng)多聚甲醛心臟灌流進(jìn)行預(yù)固定，之后取腦組織，外固定，石蠟包埋，制備病理切片，通過免疫組化分析神經(jīng)甾體合成代謝酶aromatase的表達(dá)改變。 神經(jīng)甾體提取：參考本實驗室已有方法略加改進(jìn)，通過液液萃取提取神經(jīng)甾體。腦組織樣品（雙側(cè)海馬組織或前額葉皮質(zhì)）加入PBS及MT（內(nèi)標(biāo)），制備組織勻漿。乙酸乙酯/正己烷（9:1）萃取3次，轉(zhuǎn)移并合并有機(jī)相，50℃水浴下N2吹干；60℃水浴中用丹酰氯衍生40min，離心后取上清，4℃保存。 神經(jīng)甾體含量測定：色譜條件：色譜柱Agilent XDB C18分析柱（4.6mm×50mm）；保護(hù)柱Agilent XDB C18（4.6mm×12mm）；柱溫40℃；流動相：A水（含0.1%甲酸），B甲醇（含0.1%甲酸）；流速：0.5mL/min；洗脫梯度：0-6.5min，36%A；6.5-6.6min，30%A；6.6-17min，10%A；17-18min，36%A。進(jìn)樣量30μL，每針運行18min。質(zhì)譜條件：離子化方式：大氣壓化學(xué)離子源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）；噴霧電壓：4500V；鞘氣（N2）壓力：30L/min；輔助氣（N2）壓力：5L/min；離子檢測方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為：(m/z)299.03→(m/z)158.86、280.9（PREG），(m/z)315.03→(m/z)97、109.01（PROG），(m/z)301→(m/z)188.9、282.85（ALLO），(m/z)254.97→(m/z)132.9、158.9（17β-E2），(m/z)303.1→(m/z)97.04、109.06（MT）。 RT-PCR：按照Invitrogen公司產(chǎn)品手冊，采用TRIzol一步法，提取組織總RNA。每50-100mg腦組織加入1mL TRIzol試劑，勻漿器內(nèi)冰浴研磨、裂解組織。將裂解液移至0.1%DEPC處理并高壓滅菌的1.5mL離心管中，加入0.5mL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫孵育，離心，靜置，加等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置，離心，棄上清，75%乙醇洗沉淀，室溫晾干，20μL DEPC水溶解。按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，取等量組織總RNA，70℃水浴10min，之后迅速置于冰上；加入逆轉(zhuǎn)錄體系各組分，渦旋混勻，瞬時離心，42℃孵育1h，合成cDNA，95℃加熱3min終止反應(yīng)。參考Genbank中mRNA序列設(shè)計引物，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像。凝膠成像分析軟件進(jìn)行相對定量分析。 組織總蛋白提取與Western blot分析：組織加入RIPA裂解液，制備組織勻漿。離心取上清（即蛋白提取液），分裝，-20℃保存。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白提取液，RIPA裂解液補(bǔ)齊體積，與5×SDS上樣緩沖液混合，沸水浴加熱使蛋白變性，冷卻后上樣。穩(wěn)壓電泳，溴酚藍(lán)移動至凝膠底部時，停止電泳。切去濃縮膠，剪取與凝膠相同大小的PVDF膜，甲醇活化后，與濾紙、凝膠一起浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液，平衡15min。依次放置濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙，，20V恒壓半干轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TTBS中，37℃封閉2h。之后進(jìn)行一抗結(jié)合反應(yīng)，4℃緩慢搖動過夜。洗膜后，進(jìn)行二抗結(jié)合反應(yīng)。洗膜后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測PVDF膜上抗原抗體結(jié)合區(qū)帶。凝膠成像分析軟件進(jìn)行相對定量分析。 免疫組織化學(xué)染色分析：腦組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脫水，石蠟垂直定向包埋，5μm厚度連續(xù)切片。SP三步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，即：石蠟切片脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，自然冷卻；滴加H2O2去離子水，室溫孵育10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶影響；PBS沖洗，滴加山羊血清工作液，封閉非特異結(jié)合位點；傾去血清，滴加以PBS適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃過夜；PBS沖洗，滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育15min，PBS沖洗；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min，PBS沖洗；滴加DAB試劑顯色，鏡下控制顯色時間，自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照以PBS替代一抗，其余步驟同上。顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。以細(xì)胞中出現(xiàn)棕褐色濃染顆粒作為陽性細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)。 3孕酮對Aβ?lián)p傷大鼠行為學(xué)及組織病理學(xué)改變的影響 將50只體重210-230g雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別為溶劑對照組（假手術(shù)+蒸餾水）、Aβ?lián)p傷組、以及Aβ?lián)p傷+孕酮低、中、高劑量保護(hù)組。溶劑對照組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射5μL蒸餾水，其余組大鼠注射5μL（2g/L）Aβ25-35溶液，模型制備方法同第一部分。孕酮保護(hù)組于術(shù)后6天-12天13:30皮下注射不同劑量（4mg/kg，8mg/kg，16mg/kg）的孕酮，溶劑對照組和Aβ?lián)p傷組皮下注射等體積注射用油。術(shù)后7天-12天進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測試。行為學(xué)測試結(jié)束后取材，每組中的5只動物斷頭取腦，冰浴分離海馬，-70℃存放，通過RT-PCR及Western blot分析炎癥因子TNF-α及IL-1β表達(dá)改變；其余動物經(jīng)多聚甲醛心臟灌流進(jìn)行預(yù)固定，之后取腦組織，外固定，石蠟包埋，制備病理切片，進(jìn)行組織病理學(xué)分析。 4孕酮對Aβ所致原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)：取新生SD大鼠，75%酒精消毒，無菌條件下斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬組織。去除被膜，剪碎組織，37℃水浴中胰酶消化15-20min，用含10%FBS（fetal bovine serum）的高糖DMEM（dulbecco minimum essential medium）終止消化。吹打重懸消化后的細(xì)胞團(tuán)，至細(xì)胞團(tuán)基本消失。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，接種于多聚賴氨酸預(yù)先包被的96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，8h后換為含2%B27neuromix的Neurobasal-A培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后加入阿糖胞苷（終濃度5μg/mL）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，孵育48h后完全換液（含2%B27neuromix的Neurobasal-A培養(yǎng)液），之后隔日半量換液。體外培養(yǎng)7天-9天的細(xì)胞用于實驗。 實驗分組及處理：將1mg Aβ25-35溶于471.6μL蒸餾水中，得2mMAβ25-35溶液；混勻、分裝、-20℃凍存。用前將Aβ25-35溶液（2mM）于37℃孵育一周，使其老化、聚合。體外培養(yǎng)7天-9天的細(xì)胞，分別加入不同終濃度的Aβ25-35（1μM，10μM，50μM），繼續(xù)孵育48h，或加入終濃度10μM Aβ25-35孵育不同時間（12h，24h，48h），確定Aβ25-35對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的損傷作用。不同濃度孕酮（0.1μM，0.5μM，1μM）預(yù)處理1h或與Aβ25-35同時加入，繼續(xù)孵育48h，觀察孕酮對Aβ細(xì)胞損傷作用的影響。 細(xì)胞活力分析：接種于96孔板中的神經(jīng)元給予不同處理因素后，每孔加入20μL MTT（5mg/mL），于37℃孵育4h，棄去培養(yǎng)基，每孔各加入150μL DMSO，混勻，酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞490nm波長處的吸光度（OD值），以此表示細(xì)胞的相對活力。 5統(tǒng)計學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。定位航行實驗數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量進(jìn)行方差分析（repeated-measure analysis of variance），其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-WayANOVA）繼以LSD post hoc test進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1Aβ所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠模型的制備 1.1A25-35對大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響 定位航行實驗結(jié)果顯示，各組大鼠逃避潛伏期均隨學(xué)習(xí)天數(shù)增加而逐漸縮短；各組大鼠平均游泳速度之間無統(tǒng)計學(xué)差異；假手術(shù)組大鼠與溶劑對照組大鼠學(xué)習(xí)成績無統(tǒng)計學(xué)差異；與溶劑對照組相比，Aβ25-35損傷組大鼠逃避潛伏期顯著增加（P 0.01）。 1.2Aβ25-35對大鼠空間記憶能力的影響 空間探索實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組與溶劑對照組大鼠穿越平臺區(qū)的次數(shù)及在平臺所在象限停留時間百分比無統(tǒng)計學(xué)差異；與溶劑對照組相比，Aβ25-35損傷組大鼠穿越平臺區(qū)的次數(shù)及在平臺所在象限停留時間百分比均顯著減少（P 0.01）。 1.3Aβ25-35對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量的影響 硫堇尼氏體染色顯示，假手術(shù)組及溶劑對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元有3-4層，排列整齊、緊密，細(xì)胞形態(tài)清晰、完整，可見大量突起，尼氏體呈紫色，含量豐富，細(xì)胞核不著色，核仁深染、清晰、居中；Aβ25-35損傷組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元層數(shù)減少，排列紊亂，細(xì)胞失去原有形態(tài)，可見斷裂的突起和不完整的胞體。細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，假手術(shù)組與溶劑對照組大鼠海馬CA1區(qū)完整錐體細(xì)胞的數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異；與溶劑對照組相比，Aβ25-35損傷組大鼠海馬CA1區(qū)完整錐體細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P 0.05）。 2Aβ?lián)p傷大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)甾體合成代謝的改變 2.1Aβ?lián)p傷大鼠前額葉皮質(zhì)及海馬內(nèi)神經(jīng)甾體含量的改變 Aβ25-35注射后7天，前額葉皮質(zhì)中孕酮顯著下降（P 0.01），17β-雌二醇顯著升高（P 0.05），孕烯醇酮及別孕烯醇酮含量無統(tǒng)計學(xué)差異；Aβ25-35注射后12天，前額葉皮質(zhì)中孕酮顯著下降（P 0.01），孕烯醇酮、別孕烯醇酮及17β-雌二醇含量無統(tǒng)計學(xué)差異。 Aβ25-35注射后7天，海馬組織別孕烯醇酮顯著下降（P 0.05），孕酮顯著下降（P 0.01），17β-雌二醇顯著升高（P 0.05）。Aβ25-35注射后12天，海馬組織孕烯醇酮顯著下降（P 0.05），孕酮顯著下降（P 0.01），17β-雌二醇顯著升高（P 0.05）。 2.2Aβ?lián)p傷大鼠海馬內(nèi)CYP11A1、3β-HSD、aromatase表達(dá)的改變 RT-PCR結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，Aβ?lián)p傷大鼠海馬內(nèi)CYP11A1、3β-HSD、aromatase表達(dá)均顯著（P 0.01）增加。Western blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組與溶劑對照組大鼠海馬組織中aromatase主要表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞，aromatase陽性細(xì)胞數(shù)較少，Aβ?lián)p傷大鼠海馬內(nèi)aromatase陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P 0.01）。 3孕酮對Aβ?lián)p傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及機(jī)制 3.1孕酮對Aβ?lián)p傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用 定位航行實驗結(jié)果顯示，各組大鼠逃避潛伏期均隨學(xué)習(xí)天數(shù)增加而逐漸縮短。孕酮部分逆轉(zhuǎn)Aβ?lián)p傷引起的逃避潛伏期增加，作用呈濃度依賴性�？臻g探索實驗結(jié)果顯示，孕酮濃度依賴性改善Aβ?lián)p傷大鼠平臺區(qū)穿越次數(shù)減少及平臺所在象限停留時間百分比減少的現(xiàn)象。同時，定位航行及空間探索實驗顯示，孕酮不影響正常大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。提示，孕酮特異性改善Aβ?lián)p傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。 3.2孕酮對Aβ?lián)p傷大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量的影響 硫堇尼氏體染色結(jié)果顯示，Aβ?lián)p傷大鼠海馬CA1區(qū)域可見斷裂的突起和不完整的胞體，細(xì)胞數(shù)減少，尼氏體減少。孕酮濃度依賴性改善Aβ?lián)p傷大鼠海馬錐體細(xì)胞的損傷，增加其CA1區(qū)錐體細(xì)胞存活數(shù)（P 0.01）。 3.3孕酮對Aβ?lián)p傷大鼠海馬組織炎癥因子表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，Aβ?lián)p傷大鼠海馬組織內(nèi)炎性因子TNF-α及IL-1β表達(dá)顯著增加（P 0.01）。孕酮可抑制Aβ?lián)p傷大鼠TNF-α及IL-1β表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，作用呈濃度依賴性。Western blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，即：孕酮抑制Aβ?lián)p傷大鼠海馬組織內(nèi)TNF-α及IL-1β表達(dá)上調(diào)。 4孕酮對Aβ所致原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用 4.1Aβ以濃度、時間依賴的方式降低原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元活性 MTT結(jié)果顯示，不同濃度的Aβ作用于體外培養(yǎng)7天的海馬神經(jīng)元48h后，神經(jīng)元活力下降，其中10μM及50μM Aβ使神經(jīng)元活力顯著下降（P 0.05，P 0.01）。10μMAβ作用于海馬神經(jīng)元不同時間后神經(jīng)元活力下降，其中作用24h及48h后，細(xì)胞活力顯著下降（P 0.05）。 4.2孕酮對抗Aβ的細(xì)胞損傷作用 MTT結(jié)果顯示，10μM Aβ作用于神經(jīng)元48h后，細(xì)胞活力顯著下降（P 0.05）；孕酮可對抗Aβ引起的海馬神經(jīng)元活力下降，作用呈濃度依賴性。與Aβ?lián)p傷組相比，1μM孕酮處理組海馬神經(jīng)元活力顯著增加（P0.05）；與Aβ?lián)p傷組相比，0.5μM及1μM孕酮預(yù)處理組細(xì)胞活力顯著增加（P 0.05，P 0.01）。 結(jié)論： 1雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35損傷大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞，引起大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，Aβ所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠模型制備成功。 2Aβ?lián)p傷大鼠腦組織中孕烯醇酮及孕酮含量降低，17β 雌二醇含量增加，同時，神經(jīng)甾體合成代謝酶CYP11A1、3β-HSD、aromatase表達(dá)上調(diào)。推測，Aβ上調(diào)3β HSD及aromatase表達(dá)，孕烯醇酮及孕酮分解加快，引起二者含量下降，其代謝產(chǎn)物雌二醇含量上升；機(jī)體通過增加神經(jīng)甾體合成限速酶CYP11A1的表達(dá)代償孕烯醇酮及孕酮含量的下降，Aβ促進(jìn)神經(jīng)甾體代謝向生成雌二醇的方向進(jìn)行。 3外源性給予孕酮改善Aβ?lián)p傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，對抗Aβ?lián)p傷大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞損傷，抑制Aβ?lián)p傷大鼠海馬組織中的炎癥反應(yīng)。抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用可能是孕酮改善Aβ?lián)p傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制之一。 4孕酮濃度依賴性對抗Aβ引起的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元活力下降，從細(xì)胞水平進(jìn)一步證實孕酮對Aβ?lián)p傷具有保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16;R965

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本文編號：1543752