本文關(guān)鍵詞： HCN通道 甲基苯丙胺成癮 自身給藥 清醒動(dòng)物微透析 膜片鉗　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來(lái),在我國(guó)以甲基苯丙胺為代表的合成毒品正在逐漸取代經(jīng)典毒品海洛因等而成為主導(dǎo)毒品。相對(duì)傳統(tǒng)毒品而言,合成毒品更易成癮、對(duì)成癮者中樞神經(jīng)的損傷更嚴(yán)重;此外,合成毒品成癮還嚴(yán)重危害國(guó)家安全、社會(huì)穩(wěn)定、人口素質(zhì)和公共衛(wèi)生水平。合成毒品能造成如此嚴(yán)重危害的根本原因是合成毒品成癮的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明,沒(méi)有理想的干預(yù)靶標(biāo)和藥物。因此,深入開(kāi)展合成毒品成癮神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究,尋找有效的抗合成毒品成癮的干預(yù)藥物成為本研究領(lǐng)域最急需解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元向伏隔核、海馬、前額葉皮層、杏仁核等不同腦區(qū)的投射構(gòu)成了獎(jiǎng)賞環(huán)路,是藥物成癮最重要的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。其中,中腦腹側(cè)被蓋區(qū)向伏隔核的多巴胺能投射與藥物引起的正性強(qiáng)化作用密切相關(guān),是成癮啟動(dòng)的關(guān)鍵。此外,中腦腹側(cè)被蓋區(qū)投射到海馬、前額葉皮層、杏仁核的多巴胺能神經(jīng)元構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),改變投射到中腦腹側(cè)被蓋區(qū)和伏隔核的谷氨酸能神經(jīng)元功能,與關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)記憶相關(guān)。成癮性物質(zhì)對(duì)谷氨酸能神經(jīng)投射的作用放大了成癮機(jī)體對(duì)線(xiàn)索、環(huán)境的敏感性,是強(qiáng)迫性用藥產(chǎn)生的基礎(chǔ),是引起強(qiáng)迫性用藥后復(fù)吸的根本因素。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核和海馬在藥物成癮的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。合成毒品甲基苯丙胺引起的強(qiáng)大獎(jiǎng)賞效應(yīng)是其引發(fā)成癮行為的始動(dòng)因素,而由甲基苯丙胺引起的、獎(jiǎng)賞環(huán)路細(xì)胞外多巴胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度的快速升高是甲基苯丙胺誘發(fā)正性強(qiáng)化效應(yīng),形成關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)記憶,進(jìn)一步導(dǎo)致成癮發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為,甲基苯丙胺主要通過(guò)作用于質(zhì)膜多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體2,抑制多巴胺重?cái)z取,促進(jìn)多巴胺逆轉(zhuǎn)運(yùn),從而增加細(xì)胞外多巴胺水平。然而,這一假說(shuō)并不能圓滿(mǎn)解釋甲基苯丙胺成癮和神經(jīng)性毒性等全部實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。那么,甲基苯丙胺成癮是否還存在其它的新機(jī)制呢?甲基苯丙胺能否直接參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能從而發(fā)揮作用呢?這可能為研究甲基苯丙胺成癮的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制和干預(yù)策略提供新線(xiàn)索和新思路。超極化激活的環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子(Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated,HCN)通道廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),是介導(dǎo)超極化激活非選擇性陽(yáng)離子電流Ih的離子通道。其生理功能包括:(1)調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和節(jié)律性活動(dòng);(2)維持靜息膜電位及神經(jīng)元放電的共振;(3)控制膜電阻和突觸整合;(4)影響神經(jīng)元的突觸傳遞及突觸可塑性�；谝陨涎芯�,人們認(rèn)為HCN通道可能參與了情感、認(rèn)知、神經(jīng)內(nèi)分泌等重要生理功能的調(diào)節(jié)和驚厥、癲癇、神經(jīng)性痛、帕金森病及年齡相關(guān)記憶下降等多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的病理生理學(xué)過(guò)程。甲基苯丙胺對(duì)HCN通道有何作用,HCN通道對(duì)神經(jīng)元興奮性和突觸傳遞的調(diào)節(jié)作用,是否可能成為甲基苯丙胺成癮的新機(jī)制?本文首次對(duì)HCN通道是否參與甲基苯丙胺成癮及其可能神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制開(kāi)展了較系統(tǒng)的研究工作,初步揭示了甲基苯丙胺上調(diào)中腦邊緣多巴胺獎(jiǎng)賞系統(tǒng)功能的可能新機(jī)制,為全面闡明甲基苯丙胺成癮神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供了新線(xiàn)索,為發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)、研發(fā)新藥物、防治甲基苯丙胺成癮提供了新思路。本文的主要具體發(fā)現(xiàn)是:一、HCN通道與甲基苯丙胺成癮的關(guān)系(一)干預(yù)HCN通道對(duì)甲基苯丙胺成癮行為的影響為了較為全面的研究HCN通道在甲基苯丙胺成癮過(guò)程中發(fā)揮的作用,本文以選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288為工具,在多個(gè)成癮模型上觀察了干預(yù)HCN通道對(duì)成癮行為的調(diào)節(jié)作用。1、自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)在大鼠活動(dòng)性實(shí)驗(yàn)中,本文首先研究了側(cè)腦室給予選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288對(duì)甲基苯丙胺精神興奮效應(yīng)的影響。1)側(cè)腦室單次注射ZD7288(0.312,0.625,1.25,2.5μg)不影響大鼠基礎(chǔ)活動(dòng)(P0.05,n=6);2)側(cè)腦室單次注射ZD7288(0.625,1.25μg)顯著減弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)大鼠高活動(dòng)性(P0.01,n=8)。以上結(jié)果表明阻斷HCN通道減弱甲基苯丙胺的精神興奮效應(yīng)(正性強(qiáng)化效應(yīng)),但對(duì)動(dòng)物基礎(chǔ)活動(dòng)沒(méi)有影響,提示HCN通道參與了甲基苯丙胺的精神興奮效應(yīng)。2、自身給藥實(shí)驗(yàn)(1)對(duì)正性強(qiáng)化效應(yīng)的影響在自身給藥模型中,研究了選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288對(duì)甲基苯丙胺正性強(qiáng)化效應(yīng)的影響。(1)在大鼠自身給藥模型固定比率(Fixed Ratio,FR)程序下,研究發(fā)現(xiàn):1)側(cè)腦室伴隨給予ZD7288(0.625μg)減弱低劑量甲基苯丙胺(0.0125mg/kg/infusion,i.v.)用藥行為的形成(P0.01,n=6-8);側(cè)腦室單次給予ZD7288(0.3125,0.625μg)亦能減弱低劑量甲基苯丙胺(0.0125mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)的用藥行為(P0.01,n=8),但對(duì)高劑量甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)的用藥行為無(wú)顯著影響(P0.05,n=4-6);2)為了確定HCN通道發(fā)揮作用的靶腦區(qū),選擇了與獎(jiǎng)賞系統(tǒng)關(guān)系最為密切的伏隔核進(jìn)行干預(yù),單次雙側(cè)伏隔核注射ZD7288(0.3125,0.625μg/側(cè))能夠顯著性減弱高劑量甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)的用藥行為(P0.001,n=10)。(2)同樣,在大鼠自身給藥模型累進(jìn)比率(Progressive Ratio,PR)程序下研究發(fā)現(xiàn):1)單次側(cè)腦室注射ZD7288(0.3125,0.625μg)減弱甲基苯丙胺(0.05mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)用藥動(dòng)機(jī)(P0.01,n=11);2)單次雙側(cè)伏隔核注射ZD7288(0.3125,0.625μg/側(cè))更加顯著地減弱甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)用藥動(dòng)機(jī)(P0.001,n=9)。以上結(jié)果提示在成癮的形成和維持期HCN通道參與甲基苯丙胺的正性強(qiáng)化效應(yīng)及其誘發(fā)用藥動(dòng)機(jī),伏隔核可能是HCN通道影響甲基苯丙胺獎(jiǎng)賞效應(yīng)的靶核團(tuán)。(2)阻斷HCN通道對(duì)復(fù)吸的影響1)伴隨消退訓(xùn)練側(cè)腦室注射選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288(0.625,1.25μg)不影響甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)的復(fù)吸行為(P0.05,n=9-12);2)藥物點(diǎn)燃前,單次雙側(cè)伏隔核注射阻斷劑ZD7288(0.3125,0.625μg/側(cè))不影響甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)的復(fù)吸行為(P0.05,n=8);3)線(xiàn)索點(diǎn)燃前,單次雙側(cè)伏隔核注射阻斷劑ZD7288(0.3125,0.625μg/側(cè))不影響藥物相關(guān)線(xiàn)索誘發(fā)的復(fù)吸行為(P0.05,n=7-8)。全腦干預(yù)HCN通道可能對(duì)復(fù)吸環(huán)路的特異性較差,掩蓋了阻斷劑的作用。伏隔核核區(qū)HCN通道對(duì)藥物、線(xiàn)索觸發(fā)復(fù)吸的過(guò)程可能沒(méi)有影響,對(duì)代償性適應(yīng)階段的作用有待進(jìn)一步研究。同時(shí),HCN通道的不同亞型在復(fù)吸環(huán)路中發(fā)揮的作用可能不盡相同,不同亞型的作用可能相互拮抗。ZD7288由于對(duì)HCN通道各亞型沒(méi)有選擇性,其對(duì)復(fù)吸行為的影響可能不明顯。關(guān)于HCN通道不同亞型的作用、其他核團(tuán)(如前額葉皮層)中HCN通道的作用、以及HCN通道在應(yīng)激誘發(fā)復(fù)吸中的作用,還有待進(jìn)一步研究。3、阻斷HCN通道對(duì)甲基苯丙胺誘發(fā)情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)的作用在大鼠條件性位置偏愛(ài)(Conditioned Place Preference,CPP)實(shí)驗(yàn)中,我們研究發(fā)現(xiàn)在CPP形成期側(cè)腦室伴隨給予選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288(0.625,1.25μg)減弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)CPP效應(yīng)的形成,提示HCN通道參與甲基苯丙胺誘發(fā)情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)(P0.01,n=10-13)。(二)在甲基苯丙胺成癮過(guò)程中HCN通道m(xù) RNA表達(dá)的改變以上研究結(jié)果提示,HCN通道參與了甲基苯丙胺成癮行為的調(diào)控,那么甲基苯丙胺成癮過(guò)程中,HCN通道的表達(dá)又發(fā)生了怎樣的改變呢?采用經(jīng)典的自身給藥模型,在甲基苯丙胺成癮的形成、戒斷早期、戒斷晚期以及藥物點(diǎn)燃四個(gè)階段觀察HCN通道各亞型蛋白的m RNA水平的表達(dá)變化。與沒(méi)有接觸過(guò)甲基苯丙胺的空白動(dòng)物相比,模型組動(dòng)物:(1)伏隔核中HCN1 m RNA表達(dá)水平在形成期、戒斷早期、戒斷晚期均無(wú)顯著性變化(P0.05),在藥物點(diǎn)燃時(shí)顯著升高(P0.05);HCN2 m RNA表達(dá)水平在形成期升高(P0.01),在戒斷早期恢復(fù)正常水平(P0.05),在戒斷晚期再次升高(P0.05),在藥物點(diǎn)燃時(shí)有升高的趨勢(shì)(P0.05)。(n=5-8)(2)海馬中HCN1 m RNA的表達(dá)水平在形成期有降低的趨勢(shì)(P0.05),在戒斷早期回到正常水平,在戒斷晚期和藥物點(diǎn)燃時(shí)有升高的趨勢(shì)(P0.05),但藥物點(diǎn)燃時(shí)相對(duì)于形成期顯著升高(P0.05);HCN2 m RNA水平的表達(dá)在形成期和戒斷早期有減少的趨勢(shì)(P0.05),在戒斷晚期有升高的趨勢(shì)(P0.05),藥物點(diǎn)燃時(shí)時(shí)沒(méi)有變化(P0.05),但戒斷晚期相對(duì)于形成期顯著升高(P0.05)。(n=4-7)(3)前額葉皮層HCN1 m RNA水平的表達(dá)在形成期、戒斷早期、戒斷晚期和藥物點(diǎn)燃時(shí)均顯著降低(P0.001,P0.001,P0.01,P0.001);HCN2 m RNA水平的表達(dá)在形成期、戒斷早期有升高的趨勢(shì)(P0.05),戒斷晚期繼續(xù)升高(P0.05),在藥物點(diǎn)燃時(shí)又回落(P0.05)。(n=5-7)(4)背側(cè)紋狀體HCN1 m RNA水平的表達(dá)在形成期、戒斷早期、戒斷晚期和藥物點(diǎn)燃時(shí)均顯著降低(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01);HCN2 m RNA水平的表達(dá)在形成期有升高的趨勢(shì)(P0.05),后隨著戒斷點(diǎn)燃逐漸回到正常水平,但變化沒(méi)有顯著性差異(P0.05)。(n=5-7)以上結(jié)果提示,HCN1和HCN2通道亞型在成癮過(guò)程中m RNA表達(dá)發(fā)生改變,HCN通道可能參與甲基苯丙胺成癮過(guò)程。形成期伏隔核HCN2亞型的m RNA表達(dá)上調(diào),結(jié)合第一部分阻斷劑的藥效學(xué)作用和HCN2激活后興奮神經(jīng)元,提示HCN通道參與甲基苯丙胺正性強(qiáng)化作用可能是通過(guò)伏隔核的HCN2亞型發(fā)揮的。但這僅是m RNA水平的表達(dá)變化,需要進(jìn)一步在蛋白水平進(jìn)行深入驗(yàn)證。同時(shí),我們的結(jié)果提示HCN通道同一亞型在成癮不同階段發(fā)揮了不同調(diào)節(jié)作用,這為闡明甲基苯丙胺成癮全過(guò)程的機(jī)制提供了新的研究線(xiàn)索。二、HCN通道調(diào)節(jié)甲基苯丙胺成癮的機(jī)制研究。以上研究結(jié)果提示,HCN通道可能參與甲基苯丙胺成癮,那么其機(jī)制又是怎樣的呢?本研究分別從神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)兩方面進(jìn)行機(jī)制的闡明。1.神經(jīng)化學(xué)機(jī)制伏隔核多巴胺和谷氨酸含量的增加是甲基苯丙胺正性強(qiáng)化作用和情境關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)。HCN通道參與甲基苯丙胺的正性強(qiáng)化作用和情境關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)記憶,那么其對(duì)于伏隔核多巴胺和谷氨酸含量的增加是否有影響呢?我們采用清醒動(dòng)物微透析聯(lián)合高效液相-電化學(xué)/熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)阻斷HCN通道對(duì)成癮關(guān)鍵核團(tuán)伏隔核內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)側(cè)腦室單次注射阻斷劑ZD7288(0.625,1.25μg)減弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)的伏隔核內(nèi)多巴胺水平的迅速升高(P0.01),但不影響伏隔核內(nèi)多巴胺基礎(chǔ)水平(P0.05);(n=5)(2)側(cè)腦室單次注射阻斷劑ZD7288(0.625,1.25μg)減弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)的伏隔核內(nèi)谷氨酸水平的持久升高(P0.05),但不影響谷氨酸基礎(chǔ)水平(P0.05)。(n=4-5)提示甲基苯丙胺對(duì)伏隔核內(nèi)多巴胺和谷氨酸含量的上調(diào)作用與其激活HCN通道相關(guān),構(gòu)成了甲基苯丙胺成癮的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.神經(jīng)元興奮性機(jī)制那么,HCN通道是如何參與甲基苯丙胺誘發(fā)的細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)增加的呢?我們采用電生理實(shí)驗(yàn)方法,從神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性方面,對(duì)HCN通道參與甲基苯丙胺成癮的機(jī)制展開(kāi)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)以gap-free模式記錄細(xì)胞的放電活動(dòng),發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺(1μM)增強(qiáng)了大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的動(dòng)作電位頻率,并使細(xì)胞膜去極化(P0.05,n=11);TTX(1μM)阻斷Na+通道后,甲基苯丙胺仍可使細(xì)胞膜去極化(P0.05,n=11);ZD7288(10μM)和TTX(1μM)共同存在的情況下,甲基苯丙胺的作用被逆轉(zhuǎn)(P0.05,n=11)。提示HCN通道參與甲基苯丙胺對(duì)神經(jīng)元放電頻率的增強(qiáng)作用。(2)在大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上,用TTX(1μM)和Ba Cl2(200μM)阻斷Na+通道及Ba2+敏感K+通道電流以分離記錄HCN通道電流,甲基苯丙胺在低濃度(0.1,1μM)增強(qiáng)HCN通道電流幅度(P0.001,n=15),但高濃度時(shí)(10μM)減少HCN通道電流幅度(P0.001,n=15);使用多巴胺D1/D5受體拮抗劑SCH23390(1,5,10μM)只能部分逆轉(zhuǎn)甲基苯丙胺(1μM)增強(qiáng)HCN通道電流的作用(P0.05,n=7)。提示甲基苯丙胺增強(qiáng)HCN通道電流不僅存在依賴(lài)于多巴胺系統(tǒng)的機(jī)制,還存在其它的機(jī)制。(3)與大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上觀察到的現(xiàn)象一致,分別在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)外源性HCN1和HCN2,甲基苯丙胺在低濃度(0.1,1μM)增強(qiáng)HCN1、HCN2通道電流幅度(P0.05,n=9-10),但高濃度甲基苯丙胺(10μM)減少HCN1、HCN2通道電流幅度(P0.001,n=9-10)。由于爪蟾卵母細(xì)胞幾乎不表達(dá)能夠調(diào)節(jié)HCN通道功能的G蛋白偶聯(lián)受體,以上結(jié)果提示甲基苯丙胺可能直接激活HCN通道。(4)甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)增強(qiáng)大鼠海馬Sc-CA1興奮性突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term Potentiation,LTP)(P0.001,n=12),提前海馬CA1區(qū)微注射ZD7288(0.625μg)后,甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠海馬Sc-CA1興奮性突觸LTP增強(qiáng)被抑制(P0.05,n=12),提示甲基苯丙胺誘發(fā)的LTP增強(qiáng)依賴(lài)于其對(duì)HCN通道的激活。以上結(jié)果提示,甲基苯丙胺能夠增強(qiáng)HCN通道電流,使膜電位向去極化方向移動(dòng),增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺增強(qiáng)HCN通道電流不僅存在依賴(lài)于多巴胺系統(tǒng)的機(jī)制,還有可能是甲基苯丙胺對(duì)HCN通道的直接作用。同時(shí),甲基苯丙胺通過(guò)激活HCN通道增強(qiáng)LTP,誘發(fā)海馬突觸可塑性的改變,參與甲基苯丙胺誘發(fā)情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)。綜上所述,本課題首次證明HCN通道參與了甲基苯丙胺成癮病理生理學(xué)過(guò)程。首先,在多種動(dòng)物成癮模型中,選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288能夠顯著降低甲基苯丙胺的興奮性和正性強(qiáng)化作用,及其誘發(fā)的情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)。伏隔核可能是其發(fā)揮興奮性和正性強(qiáng)化作用的關(guān)鍵核團(tuán)。其次,在甲基苯丙胺成癮的不同階段,HCN通道的HCN1和HCN2亞型在不同核團(tuán)的m RNA水平表達(dá)改變,伏隔核中HCN2的表達(dá)變化趨勢(shì)與其阻斷后的藥效學(xué)作用相一致。最后,在神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究中,利用清醒動(dòng)物微透析和電生理實(shí)驗(yàn),首次發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺能通過(guò)直接和間接兩個(gè)途徑上調(diào)HCN通道功能。一方面,甲基苯丙胺能夠直接作用于多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體,增加細(xì)胞外多巴胺含量,激活多巴胺D1/D5受體,增加細(xì)胞內(nèi)c AMP含量,從而激活c AMP敏感的HCN通道;另一方面,甲基苯丙胺可能直接激活HCN通道。HCN通道的激活使得神經(jīng)元興奮性增強(qiáng),進(jìn)一步增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,增強(qiáng)LTP,影響神經(jīng)元突觸可塑性,從而參與甲基苯丙胺的精神興奮效應(yīng)、正性強(qiáng)化效應(yīng)和情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí),最終引起成癮行為。本課題的研究為闡明甲基苯丙胺成癮神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供了新線(xiàn)索,為其治療藥物及策略研發(fā)提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R749.64
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本文編號(hào)：1537549