本文關(guān)鍵詞： HCN通道 甲基苯丙胺成癮 自身給藥 清醒動物微透析 膜片鉗　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來,在我國以甲基苯丙胺為代表的合成毒品正在逐漸取代經(jīng)典毒品海洛因等而成為主導(dǎo)毒品。相對傳統(tǒng)毒品而言,合成毒品更易成癮、對成癮者中樞神經(jīng)的損傷更嚴重;此外,合成毒品成癮還嚴重危害國家安全、社會穩(wěn)定、人口素質(zhì)和公共衛(wèi)生水平。合成毒品能造成如此嚴重危害的根本原因是合成毒品成癮的神經(jīng)生物學(xué)機制尚未完全闡明,沒有理想的干預(yù)靶標和藥物。因此,深入開展合成毒品成癮神經(jīng)生物學(xué)機制研究,尋找有效的抗合成毒品成癮的干預(yù)藥物成為本研究領(lǐng)域最急需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元向伏隔核、海馬、前額葉皮層、杏仁核等不同腦區(qū)的投射構(gòu)成了獎賞環(huán)路,是藥物成癮最重要的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。其中,中腦腹側(cè)被蓋區(qū)向伏隔核的多巴胺能投射與藥物引起的正性強化作用密切相關(guān),是成癮啟動的關(guān)鍵。此外,中腦腹側(cè)被蓋區(qū)投射到海馬、前額葉皮層、杏仁核的多巴胺能神經(jīng)元構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),改變投射到中腦腹側(cè)被蓋區(qū)和伏隔核的谷氨酸能神經(jīng)元功能,與關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)記憶相關(guān)。成癮性物質(zhì)對谷氨酸能神經(jīng)投射的作用放大了成癮機體對線索、環(huán)境的敏感性,是強迫性用藥產(chǎn)生的基礎(chǔ),是引起強迫性用藥后復(fù)吸的根本因素。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核和海馬在藥物成癮的過程中發(fā)揮著重要作用。合成毒品甲基苯丙胺引起的強大獎賞效應(yīng)是其引發(fā)成癮行為的始動因素,而由甲基苯丙胺引起的、獎賞環(huán)路細胞外多巴胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度的快速升高是甲基苯丙胺誘發(fā)正性強化效應(yīng),形成關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)記憶,進一步導(dǎo)致成癮發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的觀點認為,甲基苯丙胺主要通過作用于質(zhì)膜多巴胺轉(zhuǎn)運體和囊泡轉(zhuǎn)運體2,抑制多巴胺重攝取,促進多巴胺逆轉(zhuǎn)運,從而增加細胞外多巴胺水平。然而,這一假說并不能圓滿解釋甲基苯丙胺成癮和神經(jīng)性毒性等全部實驗現(xiàn)象。那么,甲基苯丙胺成癮是否還存在其它的新機制呢?甲基苯丙胺能否直接參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能從而發(fā)揮作用呢?這可能為研究甲基苯丙胺成癮的神經(jīng)生物學(xué)機制和干預(yù)策略提供新線索和新思路。超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子(Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated,HCN)通道廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),是介導(dǎo)超極化激活非選擇性陽離子電流Ih的離子通道。其生理功能包括:(1)調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和節(jié)律性活動;(2)維持靜息膜電位及神經(jīng)元放電的共振;(3)控制膜電阻和突觸整合;(4)影響神經(jīng)元的突觸傳遞及突觸可塑性。基于以上研究,人們認為HCN通道可能參與了情感、認知、神經(jīng)內(nèi)分泌等重要生理功能的調(diào)節(jié)和驚厥、癲癇、神經(jīng)性痛、帕金森病及年齡相關(guān)記憶下降等多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的病理生理學(xué)過程。甲基苯丙胺對HCN通道有何作用,HCN通道對神經(jīng)元興奮性和突觸傳遞的調(diào)節(jié)作用,是否可能成為甲基苯丙胺成癮的新機制?本文首次對HCN通道是否參與甲基苯丙胺成癮及其可能神經(jīng)生物學(xué)機制開展了較系統(tǒng)的研究工作,初步揭示了甲基苯丙胺上調(diào)中腦邊緣多巴胺獎賞系統(tǒng)功能的可能新機制,為全面闡明甲基苯丙胺成癮神經(jīng)生物學(xué)機制提供了新線索,為發(fā)現(xiàn)新靶標、研發(fā)新藥物、防治甲基苯丙胺成癮提供了新思路。本文的主要具體發(fā)現(xiàn)是:一、HCN通道與甲基苯丙胺成癮的關(guān)系(一)干預(yù)HCN通道對甲基苯丙胺成癮行為的影響為了較為全面的研究HCN通道在甲基苯丙胺成癮過程中發(fā)揮的作用,本文以選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288為工具,在多個成癮模型上觀察了干預(yù)HCN通道對成癮行為的調(diào)節(jié)作用。1、自發(fā)活動實驗在大鼠活動性實驗中,本文首先研究了側(cè)腦室給予選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288對甲基苯丙胺精神興奮效應(yīng)的影響。1)側(cè)腦室單次注射ZD7288(0.312,0.625,1.25,2.5μg)不影響大鼠基礎(chǔ)活動(P0.05,n=6);2)側(cè)腦室單次注射ZD7288(0.625,1.25μg)顯著減弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)大鼠高活動性(P0.01,n=8)。以上結(jié)果表明阻斷HCN通道減弱甲基苯丙胺的精神興奮效應(yīng)(正性強化效應(yīng)),但對動物基礎(chǔ)活動沒有影響,提示HCN通道參與了甲基苯丙胺的精神興奮效應(yīng)。2、自身給藥實驗(1)對正性強化效應(yīng)的影響在自身給藥模型中,研究了選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288對甲基苯丙胺正性強化效應(yīng)的影響。(1)在大鼠自身給藥模型固定比率(Fixed Ratio,FR)程序下,研究發(fā)現(xiàn):1)側(cè)腦室伴隨給予ZD7288(0.625μg)減弱低劑量甲基苯丙胺(0.0125mg/kg/infusion,i.v.)用藥行為的形成(P0.01,n=6-8);側(cè)腦室單次給予ZD7288(0.3125,0.625μg)亦能減弱低劑量甲基苯丙胺(0.0125mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)的用藥行為(P0.01,n=8),但對高劑量甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)的用藥行為無顯著影響(P0.05,n=4-6);2)為了確定HCN通道發(fā)揮作用的靶腦區(qū),選擇了與獎賞系統(tǒng)關(guān)系最為密切的伏隔核進行干預(yù),單次雙側(cè)伏隔核注射ZD7288(0.3125,0.625μg/側(cè))能夠顯著性減弱高劑量甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)的用藥行為(P0.001,n=10)。(2)同樣,在大鼠自身給藥模型累進比率(Progressive Ratio,PR)程序下研究發(fā)現(xiàn):1)單次側(cè)腦室注射ZD7288(0.3125,0.625μg)減弱甲基苯丙胺(0.05mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)用藥動機(P0.01,n=11);2)單次雙側(cè)伏隔核注射ZD7288(0.3125,0.625μg/側(cè))更加顯著地減弱甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/infusion,i.v.)誘發(fā)用藥動機(P0.001,n=9)。以上結(jié)果提示在成癮的形成和維持期HCN通道參與甲基苯丙胺的正性強化效應(yīng)及其誘發(fā)用藥動機,伏隔核可能是HCN通道影響甲基苯丙胺獎賞效應(yīng)的靶核團。(2)阻斷HCN通道對復(fù)吸的影響1)伴隨消退訓(xùn)練側(cè)腦室注射選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288(0.625,1.25μg)不影響甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)的復(fù)吸行為(P0.05,n=9-12);2)藥物點燃前,單次雙側(cè)伏隔核注射阻斷劑ZD7288(0.3125,0.625μg/側(cè))不影響甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)的復(fù)吸行為(P0.05,n=8);3)線索點燃前,單次雙側(cè)伏隔核注射阻斷劑ZD7288(0.3125,0.625μg/側(cè))不影響藥物相關(guān)線索誘發(fā)的復(fù)吸行為(P0.05,n=7-8)。全腦干預(yù)HCN通道可能對復(fù)吸環(huán)路的特異性較差,掩蓋了阻斷劑的作用。伏隔核核區(qū)HCN通道對藥物、線索觸發(fā)復(fù)吸的過程可能沒有影響,對代償性適應(yīng)階段的作用有待進一步研究。同時,HCN通道的不同亞型在復(fù)吸環(huán)路中發(fā)揮的作用可能不盡相同,不同亞型的作用可能相互拮抗。ZD7288由于對HCN通道各亞型沒有選擇性,其對復(fù)吸行為的影響可能不明顯。關(guān)于HCN通道不同亞型的作用、其他核團(如前額葉皮層)中HCN通道的作用、以及HCN通道在應(yīng)激誘發(fā)復(fù)吸中的作用,還有待進一步研究。3、阻斷HCN通道對甲基苯丙胺誘發(fā)情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)的作用在大鼠條件性位置偏愛(Conditioned Place Preference,CPP)實驗中,我們研究發(fā)現(xiàn)在CPP形成期側(cè)腦室伴隨給予選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288(0.625,1.25μg)減弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)CPP效應(yīng)的形成,提示HCN通道參與甲基苯丙胺誘發(fā)情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)(P0.01,n=10-13)。(二)在甲基苯丙胺成癮過程中HCN通道m(xù) RNA表達的改變以上研究結(jié)果提示,HCN通道參與了甲基苯丙胺成癮行為的調(diào)控,那么甲基苯丙胺成癮過程中,HCN通道的表達又發(fā)生了怎樣的改變呢?采用經(jīng)典的自身給藥模型,在甲基苯丙胺成癮的形成、戒斷早期、戒斷晚期以及藥物點燃四個階段觀察HCN通道各亞型蛋白的m RNA水平的表達變化。與沒有接觸過甲基苯丙胺的空白動物相比,模型組動物:(1)伏隔核中HCN1 m RNA表達水平在形成期、戒斷早期、戒斷晚期均無顯著性變化(P0.05),在藥物點燃時顯著升高(P0.05);HCN2 m RNA表達水平在形成期升高(P0.01),在戒斷早期恢復(fù)正常水平(P0.05),在戒斷晚期再次升高(P0.05),在藥物點燃時有升高的趨勢(P0.05)。(n=5-8)(2)海馬中HCN1 m RNA的表達水平在形成期有降低的趨勢(P0.05),在戒斷早期回到正常水平,在戒斷晚期和藥物點燃時有升高的趨勢(P0.05),但藥物點燃時相對于形成期顯著升高(P0.05);HCN2 m RNA水平的表達在形成期和戒斷早期有減少的趨勢(P0.05),在戒斷晚期有升高的趨勢(P0.05),藥物點燃時時沒有變化(P0.05),但戒斷晚期相對于形成期顯著升高(P0.05)。(n=4-7)(3)前額葉皮層HCN1 m RNA水平的表達在形成期、戒斷早期、戒斷晚期和藥物點燃時均顯著降低(P0.001,P0.001,P0.01,P0.001);HCN2 m RNA水平的表達在形成期、戒斷早期有升高的趨勢(P0.05),戒斷晚期繼續(xù)升高(P0.05),在藥物點燃時又回落(P0.05)。(n=5-7)(4)背側(cè)紋狀體HCN1 m RNA水平的表達在形成期、戒斷早期、戒斷晚期和藥物點燃時均顯著降低(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01);HCN2 m RNA水平的表達在形成期有升高的趨勢(P0.05),后隨著戒斷點燃逐漸回到正常水平,但變化沒有顯著性差異(P0.05)。(n=5-7)以上結(jié)果提示,HCN1和HCN2通道亞型在成癮過程中m RNA表達發(fā)生改變,HCN通道可能參與甲基苯丙胺成癮過程。形成期伏隔核HCN2亞型的m RNA表達上調(diào),結(jié)合第一部分阻斷劑的藥效學(xué)作用和HCN2激活后興奮神經(jīng)元,提示HCN通道參與甲基苯丙胺正性強化作用可能是通過伏隔核的HCN2亞型發(fā)揮的。但這僅是m RNA水平的表達變化,需要進一步在蛋白水平進行深入驗證。同時,我們的結(jié)果提示HCN通道同一亞型在成癮不同階段發(fā)揮了不同調(diào)節(jié)作用,這為闡明甲基苯丙胺成癮全過程的機制提供了新的研究線索。二、HCN通道調(diào)節(jié)甲基苯丙胺成癮的機制研究。以上研究結(jié)果提示,HCN通道可能參與甲基苯丙胺成癮,那么其機制又是怎樣的呢?本研究分別從神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)兩方面進行機制的闡明。1.神經(jīng)化學(xué)機制伏隔核多巴胺和谷氨酸含量的增加是甲基苯丙胺正性強化作用和情境關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)。HCN通道參與甲基苯丙胺的正性強化作用和情境關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)記憶,那么其對于伏隔核多巴胺和谷氨酸含量的增加是否有影響呢?我們采用清醒動物微透析聯(lián)合高效液相-電化學(xué)/熒光檢測技術(shù)檢測阻斷HCN通道對成癮關(guān)鍵核團伏隔核內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)側(cè)腦室單次注射阻斷劑ZD7288(0.625,1.25μg)減弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)的伏隔核內(nèi)多巴胺水平的迅速升高(P0.01),但不影響伏隔核內(nèi)多巴胺基礎(chǔ)水平(P0.05);(n=5)(2)側(cè)腦室單次注射阻斷劑ZD7288(0.625,1.25μg)減弱甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)誘發(fā)的伏隔核內(nèi)谷氨酸水平的持久升高(P0.05),但不影響谷氨酸基礎(chǔ)水平(P0.05)。(n=4-5)提示甲基苯丙胺對伏隔核內(nèi)多巴胺和谷氨酸含量的上調(diào)作用與其激活HCN通道相關(guān),構(gòu)成了甲基苯丙胺成癮的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.神經(jīng)元興奮性機制那么,HCN通道是如何參與甲基苯丙胺誘發(fā)的細胞外神經(jīng)遞質(zhì)增加的呢?我們采用電生理實驗方法,從神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性方面,對HCN通道參與甲基苯丙胺成癮的機制展開研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)以gap-free模式記錄細胞的放電活動,發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺(1μM)增強了大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的動作電位頻率,并使細胞膜去極化(P0.05,n=11);TTX(1μM)阻斷Na+通道后,甲基苯丙胺仍可使細胞膜去極化(P0.05,n=11);ZD7288(10μM)和TTX(1μM)共同存在的情況下,甲基苯丙胺的作用被逆轉(zhuǎn)(P0.05,n=11)。提示HCN通道參與甲基苯丙胺對神經(jīng)元放電頻率的增強作用。(2)在大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上,用TTX(1μM)和Ba Cl2(200μM)阻斷Na+通道及Ba2+敏感K+通道電流以分離記錄HCN通道電流,甲基苯丙胺在低濃度(0.1,1μM)增強HCN通道電流幅度(P0.001,n=15),但高濃度時(10μM)減少HCN通道電流幅度(P0.001,n=15);使用多巴胺D1/D5受體拮抗劑SCH23390(1,5,10μM)只能部分逆轉(zhuǎn)甲基苯丙胺(1μM)增強HCN通道電流的作用(P0.05,n=7)。提示甲基苯丙胺增強HCN通道電流不僅存在依賴于多巴胺系統(tǒng)的機制,還存在其它的機制。(3)與大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上觀察到的現(xiàn)象一致,分別在爪蟾卵母細胞表達外源性HCN1和HCN2,甲基苯丙胺在低濃度(0.1,1μM)增強HCN1、HCN2通道電流幅度(P0.05,n=9-10),但高濃度甲基苯丙胺(10μM)減少HCN1、HCN2通道電流幅度(P0.001,n=9-10)。由于爪蟾卵母細胞幾乎不表達能夠調(diào)節(jié)HCN通道功能的G蛋白偶聯(lián)受體,以上結(jié)果提示甲基苯丙胺可能直接激活HCN通道。(4)甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)增強大鼠海馬Sc-CA1興奮性突觸長時程增強(Long-term Potentiation,LTP)(P0.001,n=12),提前海馬CA1區(qū)微注射ZD7288(0.625μg)后,甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠海馬Sc-CA1興奮性突觸LTP增強被抑制(P0.05,n=12),提示甲基苯丙胺誘發(fā)的LTP增強依賴于其對HCN通道的激活。以上結(jié)果提示,甲基苯丙胺能夠增強HCN通道電流,使膜電位向去極化方向移動,增強神經(jīng)元興奮性。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺增強HCN通道電流不僅存在依賴于多巴胺系統(tǒng)的機制,還有可能是甲基苯丙胺對HCN通道的直接作用。同時,甲基苯丙胺通過激活HCN通道增強LTP,誘發(fā)海馬突觸可塑性的改變,參與甲基苯丙胺誘發(fā)情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)。綜上所述,本課題首次證明HCN通道參與了甲基苯丙胺成癮病理生理學(xué)過程。首先,在多種動物成癮模型中,選擇性HCN通道阻斷劑ZD7288能夠顯著降低甲基苯丙胺的興奮性和正性強化作用,及其誘發(fā)的情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)。伏隔核可能是其發(fā)揮興奮性和正性強化作用的關(guān)鍵核團。其次,在甲基苯丙胺成癮的不同階段,HCN通道的HCN1和HCN2亞型在不同核團的m RNA水平表達改變,伏隔核中HCN2的表達變化趨勢與其阻斷后的藥效學(xué)作用相一致。最后,在神經(jīng)生物學(xué)機制研究中,利用清醒動物微透析和電生理實驗,首次發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺能通過直接和間接兩個途徑上調(diào)HCN通道功能。一方面,甲基苯丙胺能夠直接作用于多巴胺轉(zhuǎn)運體,增加細胞外多巴胺含量,激活多巴胺D1/D5受體,增加細胞內(nèi)c AMP含量,從而激活c AMP敏感的HCN通道;另一方面,甲基苯丙胺可能直接激活HCN通道。HCN通道的激活使得神經(jīng)元興奮性增強,進一步增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,增強LTP,影響神經(jīng)元突觸可塑性,從而參與甲基苯丙胺的精神興奮效應(yīng)、正性強化效應(yīng)和情境關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí),最終引起成癮行為。本課題的研究為闡明甲基苯丙胺成癮神經(jīng)生物學(xué)機制提供了新線索,為其治療藥物及策略研發(fā)提供了新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.64
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本文編號：1537549