本文關鍵詞： 中華眼鏡蛇 神經毒素 煙堿型乙酰膽堿受體 層析　出處：《第四軍醫(yī)大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：【背景】蛇毒，是由蛇的毒腺分泌，含有多種天然的多肽組分，包括心臟毒素，神經毒素（neurotoxins，NTs），磷脂酶A2，蛇毒因子等。根據淀粉凝膠電泳[1]可將銀環(huán)蛇神經毒素分成，β兩類，其中-神經毒素作用于突觸后膜，β-神經毒素作用于突觸前膜。根據氨基酸組成的不同，又可將-神經毒素分為兩類，Ⅰ類神經毒素由70-74個氨基酸組成，含5對二硫鍵，被稱為長鏈神經毒素，與骨骼肌中的煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinicacetylcholine receptor，nAChR）親和力非常高；Ⅱ類神經毒素中含有60-62個氨基酸，4對二硫鍵，被稱為短鏈神經毒素，與nAChR的親和力較Ⅰ類低。國際上通常從印度眼鏡蛇（Naja naja naja）、泰國眼鏡蛇（Naja najaSiamensis）或孟加拉眼鏡蛇（Naja naja Kaouthia）的毒液中純化-神經毒素，后者通常被稱為眼鏡蛇毒素（cobra toxin）[2]。由于眼鏡蛇毒素與nAChR的親和力適中，所以也通常用于nAChR的純化。中華眼鏡蛇（Naja naja atra）在我國南方廣泛分布，在蛇園中也有大規(guī)模的飼養(yǎng)，其毒液價格便宜，但沒有相關報道是否能以其毒液中的-神經毒素作為親和配體純化nAChR。所以，，我們嘗試從中華眼鏡蛇的蛇毒中分離純化-神經毒素，以期獲得足夠量的毒素，用于nAChR的純化，進而建立重癥肌無力主動免疫動物模型。 【目的】從中華眼鏡蛇粗毒中分離其-神經毒素組分，利用純化的-神經毒素作為親和層析的配基耦聯(lián)至瓊脂糖凝膠上，制備成-神經毒-瓊脂糖凝膠作為介質，從大鼠骨骼肌中純化nAChR。 【方法】采用凝膠過濾層析分離出蛇毒中的低分子量蛋白，并通過125I--銀環(huán)蛇毒素（Btx）-nAChR結合抑制實驗檢測蛋白活性，選擇活性高的蛋白進一步用陽離子交換層析純化，逐步分離出眼鏡蛇-神經毒，SDS-PAGE分析蛋白分子量大小和純度；將純化的-神經毒耦聯(lián)至NHS-活化的瓊脂糖凝膠上，作為介質結合大鼠骨骼肌肌膜提取物中nAChR，0.2mol/L卡巴膽堿將受體洗脫至羥基磷灰石層析柱上，并以250mmol/L磷酸緩沖液洗脫收集，以放射免疫沉淀法測收集的洗脫液中的125I-Btx結合活性。 【結果】成功純化出有較強125I-Btx-nAChR結合抑制活性的眼鏡蛇-神經毒（Cobra VⅡc），但較天然的-銀環(huán)蛇毒素弱，其分子量約為7kDa；在濃度為0.18μg/0.5ml體系中，純化的-神經毒125I-Btx-nAChR結合抑制率約為60%；純化出的-神經毒純度可達到90%。以純化的-神經毒為配基制備的親和介質，可吸附大鼠骨骼肌膜提取物中約84%的125I-Btx結合活性，且此活性可以被0.2mol/L卡巴膽堿洗脫。 【結論】用簡單的液相色譜方法可從中華眼鏡蛇毒中分離純化-神經毒素，并且以此為配體從大鼠骨骼肌中提純nAChR。
[Abstract]:[background] Snake venom, secreted by snake's venom gland, contains a variety of natural polypeptide components, including cardiac toxin, neurotoxin neurotoxin NTsN, phospholipase A _ 2, snake venom factor and so on. The neurotoxin acts on the postsynaptic membrane and 尾 -neurotoxin on the presynaptic membrane. According to the different amino acid composition, the neurotoxin can be divided into two categories. Class I neurotoxin is composed of 70-74 amino acids and contains 5 pairs of disulfide bonds. Known as long chain neurotoxin, it has high affinity to nicotinic acetylcholine receptor nAChRin skeletal muscle, and class 鈪

本文編號：1519352