本文關(guān)鍵詞： 褪黑素 甲基苯丙胺 行為敏化 神經(jīng)毒性　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：甲基苯丙胺(Methamphetamine,MA)是一種在全球范圍內(nèi)被廣泛使用的精神興奮藥品,其濫用業(yè)已成為嚴(yán)重的社會問題。MA 具有精神依賴性和神經(jīng)毒性兩個主要特點(diǎn),其攝入后可短時間內(nèi)改變?nèi)说男袨楹驼J(rèn)知,并可誘發(fā)神經(jīng)損傷。MA的長期濫用可導(dǎo)致患者注意力、工作記憶及決策能力的缺陷,并可促發(fā)精神疾病和攻擊性行為,甚至造成顯著的神經(jīng)退行性改變。MA暴露后,患者普遍表現(xiàn)有嚴(yán)重的依賴性和很高的復(fù)吸率,這亦是其構(gòu)成嚴(yán)重社會危害的主要原因。然而,盡管人們對于MA的危害已有充分的認(rèn)識,截至目前,尚未發(fā)現(xiàn)針對MA成癮和毒性的有效方法。因此,闡明MA依賴和毒性的機(jī)制以及尋求有效的干預(yù)藥物對于MA成癮患者的臨床治療至關(guān)重要。藥物依賴表現(xiàn)為不計(jì)后果的強(qiáng)迫性覓藥和用藥行為。當(dāng)處于戒斷期的個體重新暴露于藥物相關(guān)的環(huán)境時,將引發(fā)強(qiáng)烈的覓藥渴望,從而導(dǎo)致復(fù)吸。藥物戒斷后,個體表現(xiàn)為持久的且不斷增強(qiáng)的由藥物相關(guān)暗示所引發(fā)的覓藥渴望,這種現(xiàn)象被稱為覓藥渴望孵育(Incubation of Drug Craving)。其機(jī)制尚不明確。有觀點(diǎn)認(rèn)為,反復(fù)的藥物刺激可導(dǎo)致神經(jīng)回路產(chǎn)生對于藥物激勵作用的敏化,而對于動物來說,其主要的表現(xiàn)為行為敏化。作為藥物渴求的一種表現(xiàn),行為敏化與藥物復(fù)吸密切相關(guān)。行為敏化是指在反復(fù)給予動物精神刺激性藥物后出現(xiàn)的運(yùn)動行為增加的現(xiàn)象。行為敏化可分為三個階段:誘導(dǎo)期、孵育期和表達(dá)期,即在反復(fù)給予精神刺激藥物注射(通常5-7天)后,進(jìn)行7-14天的戒斷孵育,再于最后一天注射藥物,并記錄行為變化。通常動物在經(jīng)過一段時間的孵育后會出現(xiàn)運(yùn)動劇烈增加的現(xiàn)象。目前,多數(shù)研究僅關(guān)注行為敏化的形成過程,尤其是最終敏化表達(dá)的變化,罕有文獻(xiàn)論及行為敏化孵育期的影響,特別是經(jīng)孵育過后這種運(yùn)動大幅增加的內(nèi)在機(jī)制。由于敏化孵育期亦是藥物戒斷期,而藥物戒斷將引發(fā)覓藥渴求孵育,因此,敏化孵育與戒斷孵育可能存在著共同的內(nèi)在神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。研究證實(shí),藥物戒斷,尤其是MA的戒斷,除覓藥渴求外,還伴有焦慮和抑郁等癥狀。MA戒斷病人普遍存在著抑郁和焦慮癥狀,且這些癥狀和MA的覓藥沖動以及復(fù)吸之間存在著顯著的相關(guān)性。故此,有效對抗MA戒斷后的并發(fā)癥將可能起到緩解藥物依賴的作用。大量研究證實(shí),應(yīng)激能增強(qiáng)藥物渴求和復(fù)吸,而慢性應(yīng)激將引發(fā)抑郁癥。應(yīng)激可激動下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸,誘發(fā)糖皮質(zhì)激素的分泌,而這與MA暴露的效果類似�？紤]到HPA軸與抑郁癥的緊密關(guān)系,MA對于HPA軸的激動可能是MA戒斷后容易引發(fā)抑郁癥的一個內(nèi)在原因。此外,應(yīng)激、焦慮和抑郁均可抑制海馬神經(jīng)元新生,而海馬神經(jīng)元新生的增加能有效對抗應(yīng)激和緩解抑郁癥狀,且各種抗抑郁治療均可增加海馬新生神經(jīng)元的數(shù)目。研究表明,MA自給藥可降低海馬神經(jīng)新生和增殖的能力,進(jìn)而降低海馬顆粒神經(jīng)元的數(shù)量和海馬體積。而MA暴露對于海馬神經(jīng)元新生的影響又與MA的神經(jīng)毒性有關(guān)。MA具有顯著的神經(jīng)毒性作用。MA暴露可導(dǎo)致不同腦區(qū)的灰質(zhì)丟失、白質(zhì)肥厚以及小膠質(zhì)細(xì)胞增生。MA可誘發(fā)多巴胺能和五羥色胺能神經(jīng)元末梢損傷,黑質(zhì)紋狀體通路損傷,增加患者罹患帕金森病的風(fēng)險。普遍認(rèn)為,MA的神經(jīng)毒性和腦內(nèi)多巴胺的急劇增加有關(guān)。多巴胺氧化后可產(chǎn)生活性氧簇(ROS),促發(fā)氧化損傷,并被認(rèn)為是MA具有神經(jīng)毒性的主要原因。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),MA在無多巴胺環(huán)境下亦可引發(fā)神經(jīng)損傷。故此,MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷應(yīng)該還存在著多巴胺以外的機(jī)制。有研究表明,線粒體凋亡通路亦參與了 MA的神經(jīng)損傷過程。MA暴露可導(dǎo)致線粒體膜電位的降低和鈣超載,從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此,具有抗氧化損傷和線粒體保護(hù)作用的藥物,將可能起到對抗MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的作用,而褪黑素就是其中之一。褪黑素是一種由松果體分泌的"黑暗激素"。其具有誘導(dǎo)睡眠的作用并被成功地應(yīng)用于睡眠相關(guān)疾病的治療。褪黑素還是抑郁癥的一種生物標(biāo)記物,并可緩解小鼠由慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁樣行為。此外,褪黑素確證具有抗氧化和清除自由基的作用。褪黑素可抑制特定腦區(qū)的多巴胺分泌,并參與調(diào)控與運(yùn)動性疾病相關(guān)的多巴胺神經(jīng)回路。而MA濫用將降低多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的水平,進(jìn)而導(dǎo)致運(yùn)動失常。有研究表明,褪黑素急性處理可減少M(fèi)A導(dǎo)致的高熱,但不能弱化MA誘發(fā)的行為敏化。高濃度褪黑素的急性處理能增強(qiáng)行為敏化,且于敏化表達(dá)前進(jìn)行褪黑素的急性處理并不能發(fā)揮干預(yù)敏化表達(dá)的作用。而于敏化誘導(dǎo)期反復(fù)進(jìn)行褪黑素急性干預(yù),能夠降低敏化表達(dá)。然而,尚未有文獻(xiàn)采用在敏化孵育期進(jìn)行慢性褪黑素干預(yù),且褪黑素干預(yù)敏化的機(jī)制亦鮮有論及。另外,在體和離體實(shí)驗(yàn)均表明褪黑素可對抗MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷。由此,課題選用褪黑素對敏化孵育期進(jìn)行干預(yù),以期達(dá)到最終抑制敏化表達(dá)的效果。此外,在體外實(shí)驗(yàn)中我們又研究了褪黑素對抗MA神經(jīng)損傷的作用及其分子機(jī)制。目前,藥物依賴的表觀遺傳學(xué)機(jī)制日趨為研究者所關(guān)注,而作為表觀遺傳的一部分,microRNA與藥物成癮的關(guān)系已有大量的文獻(xiàn)報道。作為一種在腦內(nèi)高表達(dá)和受pCREB調(diào)控的microRNA,miR-132對于神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性具有顯著影響。miR-132能夠靶向調(diào)控MeCP2的表達(dá),而MeCP2對于神經(jīng)元突觸功能的維持意義重大。研究表明,可卡因強(qiáng)迫性攝取和安非他命誘發(fā)的行為敏化均與MeCP2有關(guān)。且MeCP2可調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá),而后者已明確參與馬藥物成癮進(jìn)程。另據(jù)報道,BDNF可對抗MA誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡,且此過程必須有AKT的參與調(diào)控。同樣基于原代培養(yǎng)神經(jīng)元的研究表明,BDNF的暴露可顯著增加miR-132的表達(dá)。有趣的是,miR-132能促進(jìn)神經(jīng)元突起生長,而AKT作為一種促細(xì)胞存活因子,亦參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元突起的生長過程。此外,miR-132可靶向下調(diào)PTEN的表達(dá),而PTEN可抑制AKT的磷酸化。由此,miR-132可通過抑制PTEN,間接激活A(yù)KT信號通路。而AKT可激活包括GSK3β和mTOR在內(nèi)的大量下游分子。有研究證實(shí),安非他命可去磷酸化AKT/GSK3β通路,并且MA暴露可降低mTOR的磷酸化。而褪黑素可通過磷酸化AKT/GSK3β通路對抗β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的神經(jīng)損傷和激活mTOR發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用�；谏鲜鲅芯勘尘�,本實(shí)驗(yàn)假設(shè)miR-132和MeCP2在前額葉以及伏隔核的表達(dá)將受到MA的影響,并與小鼠的行為敏化密切相關(guān)。而褪黑素對于敏化表達(dá)的干預(yù)作用亦可能與miR-132和MeCP2的表達(dá)水平相關(guān)。進(jìn)而通過改變miR-132和MeCP2在NAc的表達(dá)可調(diào)節(jié)小鼠的敏化行為。關(guān)于神經(jīng)毒性,我們對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行了 MA損傷和褪黑素保護(hù),并進(jìn)一步探究了其分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)通過病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)元過表達(dá)miR-132和干擾MeCP2的表達(dá),以期可對抗MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷。實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步研究了 AKT/GSK3β/mTOR分子通路和MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的關(guān)系。第一部分褪黑素對甲基苯丙胺致行為敏化的干預(yù)作用及其機(jī)制本部分實(shí)驗(yàn),我們首先假設(shè)褪黑素在敏化孵育期的干預(yù)將緩解小鼠的MA戒斷癥狀,并可對抗MA的神經(jīng)損傷作用,從而最終導(dǎo)致行為敏化表達(dá)的弱化。小鼠行為敏化及褪黑素干預(yù)實(shí)驗(yàn)流程如下:3天的適應(yīng)期過后,我們對小鼠進(jìn)行連續(xù)7天的MA注射,誘導(dǎo)行為敏化的產(chǎn)生,并記錄其活動距離;而后是14天的敏化孵育期,我們期間對小鼠進(jìn)行連續(xù)的低劑量褪黑素處理;最后于第22天檢測小鼠行為敏化的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)敏化孵育期的褪黑素干預(yù)能降低行為敏化的表達(dá)�；谝陨辖Y(jié)果,我們進(jìn)一步探究了褪黑素對抗敏化表達(dá)的機(jī)制�？紤]到褪黑素具有明確的抗抑郁作用,加之抑郁和焦慮為MA戒斷后的主要并發(fā)癥,我們推論褪黑素可能通過緩解敏化孵育期小鼠的戒斷癥狀來發(fā)揮對抗敏化表達(dá)的作用。我們通過黑白箱實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、新環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)以及糖水偏好實(shí)驗(yàn)等反應(yīng)小鼠焦慮和抑郁狀況的實(shí)驗(yàn)證實(shí):敏化孵育期的小鼠表現(xiàn)有明顯的焦慮和抑郁,而褪黑素干預(yù)可顯著緩解小鼠的焦慮和抑郁行為。此外,由于海馬神經(jīng)元的新生情況與MA戒斷以及抑郁和焦慮癥狀關(guān)系密切,實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步通過免疫熒光染色檢測了 Brdu以及DCX在海馬的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),敏化孵育大幅降低了海馬新生神經(jīng)元的數(shù)目,而褪黑素干預(yù)可有效恢復(fù)海馬新生神經(jīng)元的水平。說明褪黑素干預(yù)可有效緩解小鼠在敏化孵育期的戒斷癥狀,并可能由此發(fā)揮對抗敏化表達(dá)的作用。為了進(jìn)一步闡明MA誘導(dǎo)的敏化表達(dá)及褪黑素干預(yù)的分子機(jī)制,我們通過PCR、免疫熒光染色以及Western blot檢測了 miR-132和MeCP2在NAc和PFC的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敏化表達(dá)后,miR-132在PFC和NAc的表達(dá)均呈現(xiàn)為降低,而褪黑素干預(yù)可顯著恢復(fù)miR-132在上述腦區(qū)的表達(dá);同樣的,免疫熒光染色和Western blot均顯示,MA誘導(dǎo)的敏化表達(dá)可大幅增加MeCP2在NAc和PFC的表達(dá),而褪黑素可有效降低MeCP2在上述腦區(qū)的表達(dá)。另據(jù)文獻(xiàn)報道,pGSK3β與敏化的始動及表達(dá)均相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)MA相應(yīng)地增加了 pGSK3β在NAc的表達(dá),而褪黑素可部分降低其表達(dá)(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。頗為意外的是,相關(guān)性分析顯示,MA對照組及鹽水對照組的MeCP2在NAc的表達(dá)與小鼠活動距離間存在著線性相關(guān)關(guān)系�；谝陨习l(fā)現(xiàn),為了進(jìn)一步明確miR-132和MeCP2在NAc的表達(dá)對于行為敏化的影響,我們進(jìn)行了 miR-132過表達(dá)以及MeCP2干擾載體的構(gòu)建和慢病毒包裝。我們于敏化孵育期的起始對NAc行慢病毒的雙側(cè)注射,分別上調(diào)miR-132和下調(diào)MeCP2的表達(dá),并于敏化孵育過后檢測其對最終敏化表達(dá)的影響。結(jié)果表明,下調(diào)MeCP2在NAc的表達(dá)可有效降低最終的敏化表達(dá),而上調(diào)miR-132在NAc的表達(dá)可部分降低敏化的表達(dá),但未取得有意義的結(jié)果。總之,本部分實(shí)驗(yàn)表明,敏化孵育期的褪黑素干預(yù)可有效降低MA誘導(dǎo)的行為敏化的表達(dá)。此干預(yù)效果可能部分與褪黑素能夠有效緩解MA戒斷所導(dǎo)致的焦慮和抑郁有關(guān)。實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步研究了 miR-132/MeCP2分子通路在敏化表達(dá)及褪黑素干預(yù)過程中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeCP2在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。第二部分褪黑素對甲基苯丙胺致神經(jīng)毒性的干預(yù)作用及其機(jī)制本部分實(shí)驗(yàn),我們在體外研究了 MA對神經(jīng)元的損傷作用及褪黑素干預(yù)的機(jī)制。首先,我們自新生鼠取得皮層神經(jīng)元并進(jìn)行原代培養(yǎng)。在培養(yǎng)第5天對神經(jīng)元進(jìn)行不同濃度的MA損傷,通過CCK-8檢測確定最佳損傷濃度。而后,我們在損傷的基礎(chǔ)上,選用不同濃度的褪黑素對神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù),并確定最佳的保護(hù)濃度�；谝陨辖Y(jié)果,我們將實(shí)驗(yàn)分為三組,即對照組,MA損傷組以及MA損傷加褪黑素保護(hù)組。首先,我們通過Shol]分析檢測了神經(jīng)元突起的形態(tài)。結(jié)果表明,MA可顯著減少初級突起的數(shù)量、樹突分支的數(shù)量以及突起長度,而褪黑素干預(yù)可有效恢復(fù)初級突起的數(shù)量、樹突分支的數(shù)量以及突起長度。然后,實(shí)驗(yàn)通過Hoechst/PI染色檢測了凋亡和壞死情況。結(jié)果表明,MA暴露可大幅增加神經(jīng)元的凋亡和壞死的數(shù)目,而褪黑素處理可顯著對抗MA的損傷作用。為了闡明MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷及褪黑素保護(hù)的分子機(jī)制,我們通過PCR檢測了 miR-132的表達(dá)變化。利用Western blot檢測了 pCREB、MeCP2和PTEN的表達(dá)變化。我們發(fā)現(xiàn)MA暴露顯著降低了 pCREB和miR-132的表達(dá),而褪黑素可有效恢復(fù)二者的表達(dá)。而作為miR-132的下游靶基因,MeCP2和PTEN在MA暴露后均出現(xiàn)了表達(dá)增高,且褪黑素保護(hù)可顯著降低二者的表達(dá)。我們利用慢病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)元,過表達(dá)miR-132或下調(diào)MeCP2的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-132可有效降低MeCP2和PTEN的表達(dá),并且下調(diào)MeCP2的表達(dá)亦可導(dǎo)致PTEN表達(dá)的降低。而后,我們對轉(zhuǎn)染過的神經(jīng)元進(jìn)行MA損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-132和下調(diào)MeCP2的表達(dá)均可有效對抗MA的損傷作用。我們還使用抑制劑下調(diào)了 PTEN的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低PTEN的表達(dá)亦有顯著的保護(hù)作用�？紤]到miR-132/PTEN對下游AKT信號通路的影響,我們進(jìn)一步研究了AKT/GSK3β/mTOR分子通路和MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷以及褪黑素保護(hù)的關(guān)系。首先,我們發(fā)現(xiàn)MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷可顯著降低AKT/GSK3β/mTOR通路各分子的磷酸化水平。而褪黑素干預(yù)可有效增加AKT/GSK3β/mTOR通路各分子的磷酸化水平。在褪黑素保護(hù)的基礎(chǔ)上,我們再通過LY294002和雷帕霉素分別抑制AKT和mTOR的磷酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種抑制劑均顯著降低了褪黑素的保護(hù)效果。說明AKT/mTOR通路參與了褪黑素的保護(hù)作用。為進(jìn)一步闡明GSK3β在MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷中的作用,我們選用氯化鋰抑制GSK3β的表達(dá)(增加GSK3β的磷酸化水平)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯化鋰在磷酸化GSK3β的同時表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)作用,并可進(jìn)一步有效增加AKT和mTOR的磷酸化水平。且LY294002和雷帕霉素均可阻滯氯化鋰的保護(hù)作用。說明氯化鋰亦通過AKT/GSK3β/mTOR信號通路對抗MA的神經(jīng)損傷作用。由此,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)AKT/GSK3β/mTOR通路各分子的去磷酸化和磷酸化在MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷及干預(yù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。總之,本部分實(shí)驗(yàn),我們通過MA損傷神經(jīng)元和褪黑素干預(yù),印證了褪黑素的神經(jīng)保護(hù)作用。并進(jìn)一步證實(shí)褪黑素可經(jīng)由miR-132/MeCP2/PTEN以及下游的AKT/GSK3β/mTOR分子通路對抗MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷作用。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)基于MA具有精神依賴性和神經(jīng)毒性的特點(diǎn),選用褪黑素作為干預(yù)藥物,從在體和離體兩個方面分別研究和闡述了褪黑素對抗MA誘導(dǎo)的行為敏化和神經(jīng)損傷的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)首次使用褪黑素對于敏化孵育期進(jìn)行慢性干預(yù),并有效地降低了 MA誘導(dǎo)的行為敏化的表達(dá)�？紤]到敏化孵育期亦是藥物戒斷期的特點(diǎn),以及褪黑素對于抑郁和焦慮等戒斷癥狀的明確作用,我們通過大量的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),褪黑素可有效緩解抑郁和焦慮等MA戒斷癥狀,并推論這可能與褪黑素緩解敏化表達(dá)的作用相關(guān)。另外,在分子機(jī)制方面,我們發(fā)現(xiàn),MA誘導(dǎo)的敏化表達(dá)可分別導(dǎo)致miR-132和MeCP2在PFC和NAc的降低和過表達(dá),而褪黑素干預(yù)可顯著增高miR-132的表達(dá)和有效降低MeCP2在上述腦區(qū)的表達(dá)。鑒于本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MeCP2在NAc的表達(dá)與小鼠活動距離之間的線性相關(guān)關(guān)系,我們通過慢病毒干擾下調(diào)了 MeCP2在NAc的表達(dá),結(jié)果顯著降低了敏化的最終表達(dá)。說明MeCP2在NAc的表達(dá)水平對于行為敏化的表達(dá)具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步闡明MA的神經(jīng)毒性作用及褪黑素保護(hù)的機(jī)制,我們設(shè)計(jì)了體外實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了褪黑素可有效對抗MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷作用。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過miR-132/MeCP2/PTEN以及下游的AKT/GSK3β/mTOR分子通路對抗MA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷作用�？傊�,本實(shí)驗(yàn)為闡明MA誘導(dǎo)的行為敏化及神經(jīng)損傷的機(jī)制及褪黑素的干預(yù)治療提供了新的線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R749.6

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Yosuke Ohtake;Umar Hayat;Shuxin Li;;PTEN inhibition and axon regeneration and neural repair[J];Neural Regeneration Research;2015年09期

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本文編號：1512820