本文關(guān)鍵詞： VTA DA能神經(jīng)元 社交失敗壓力抑郁模型 Kv7/M通道 A型鉀通道 GIRK通道 鈣激活鉀通道SK3 神經(jīng)元興奮性　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：抑郁癥是一種慢性情感障礙性疾病,患者反復(fù)持續(xù)心境低落、情緒消極,易激發(fā)自殺傾向。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè),到2020年抑郁癥將成為人類的第二大疾病。但現(xiàn)有的三環(huán)類、選擇性五羥色胺/去甲上腺素再攝取抑制劑、單胺氧化酶抑制劑等抗抑郁藥物療效并不理想,因此針對(duì)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的抗抑郁藥物治療靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)之一。近來(lái)有研究提示中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)多巴胺(DA)系統(tǒng)在動(dòng)物抑郁樣行為中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。最近的研究發(fā)現(xiàn),慢性社交挫敗(social defeat)壓力所誘發(fā)的小鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元放電活動(dòng)增加,是引發(fā)抑郁樣行為的關(guān)鍵因素,因此理解控制VTA區(qū)DA能神經(jīng)元電活動(dòng)的電生理機(jī)制十分重要。VTA區(qū)DA能神經(jīng)元以低頻的單放電和簇放電模式自發(fā)地產(chǎn)生動(dòng)作電位。簇放電導(dǎo)致大量多巴胺釋放,更高效地調(diào)節(jié)VTA及投射區(qū)域神經(jīng)元的活動(dòng)。在反復(fù)社交挫敗壓力刺激下,DA能神經(jīng)元的簇放電活動(dòng)增加,與此相關(guān),社交挫敗刺激也可導(dǎo)致VTA區(qū)DA能神經(jīng)元某些鉀通道的表達(dá)發(fā)生改變,而增加鉀通道的表達(dá)會(huì)完全消除小鼠的抑郁癥狀。另有研究發(fā)現(xiàn)敲除TREK1鉀通道可以抑制抑郁樣行為的出現(xiàn);選擇性阻斷TREK1通道也可以產(chǎn)生快速抗抑郁作用。因此,通過(guò)調(diào)節(jié)鉀通道而影響VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性可能為一種有效的治療方法。Kv7/KCNQ通道廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng),是一種以慢激活、慢去活、非失活為特征的電壓依賴性鉀通道,在控制神經(jīng)元的興奮性中發(fā)揮重要作用。Kv7通道家族主要包括Kv7.1~7.5五種亞型。在腹側(cè)中腦,Kv7.2~Kv7.5表達(dá)最為廣泛,而Kv7.4則局限高表達(dá)在VTA和黑質(zhì)(SNc)DA能神經(jīng)元中。有研究提示Kv7通道可以作為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性異常有關(guān)疾病的治療靶點(diǎn),如癲癇、疼痛、焦慮和藥物成癮等。本論文的第一部分和第二部分將對(duì)Kv7.4通道調(diào)節(jié)VTA區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性的機(jī)制展開研究,并探討Kv7.4通道與社交挫敗壓力刺激引發(fā)抑郁行為的關(guān)系。我們將利用新近發(fā)現(xiàn)的選擇性kv7.4開放劑fasudil(法舒地爾)和kv7.4基因敲除小鼠進(jìn)行上述研究。除kv7.4鉀通道外,之前研究提示其他鉀通道也可能參與了vta區(qū)da能神經(jīng)元興奮性的調(diào)控,例如girk、a型鉀通道、ca2+激活鉀通道(sk通道)等。本論文的第三部分將研究這些鉀離子通道在vta區(qū)da能神經(jīng)元的表達(dá),以及對(duì)興奮性的調(diào)節(jié),重點(diǎn)觀察a型鉀通道對(duì)da能神經(jīng)元放電頻率和放電模式的影響。第一部分kv7.4通道在vta區(qū)da能神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)中的作用目的:了解kv7.4鉀通道在調(diào)控vta區(qū)da能神經(jīng)元興奮性中的作用。方法:(1)利用免疫組化和全細(xì)胞及貼附式膜片鉗技術(shù),確定小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元中kv7.4通道的表達(dá)分布及電生理特性;并觀察kv7通道調(diào)節(jié)劑對(duì)vta區(qū)da能神經(jīng)元的kv7/m電流、靜息膜電位、誘發(fā)放電和自發(fā)放電的影響。(2)利用免疫熒光成像技術(shù),觀察kv7.4通道在vta區(qū)da能神經(jīng)元上的表達(dá)。結(jié)果:(1)小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元電生理特征鑒定:-300pa的超極化電流誘發(fā)“sag”內(nèi)向整流特性電位,電位平均幅度為60.2±3.7mv(野生小鼠)。自發(fā)性動(dòng)作電位時(shí)程從開始至波谷的時(shí)間間隔為2.6±0.1ms,從開始至電位恢復(fù)到正常水平的時(shí)間間隔為5.5±0.2ms;平均放電頻率分別為1.3±0.1hz。(2)免疫熒光結(jié)果顯示kv7.4通道高表達(dá)在vta外側(cè)和部分黑質(zhì)致密部的th免疫陽(yáng)性神經(jīng)元中;kv7.4基因敲除小鼠(kv7.4-/-)中未見kv7.4表達(dá)。非選擇性kv7通道開放劑rtg可濃度依賴性地增加vta區(qū)da能神經(jīng)元的kv7/m樣電流,ec50為3.4±0.3μm;10μmrtg使kv7/m樣電流從45.6±9.1pa增大至80.2±14.1pa(p0.01);kv7阻斷劑xe911(3μm)使kv7/m樣電流從59.1±6.4pa降低至26.0±3.1pa(p0.01),抑制率為45.6±6.0%;在kv7.4-/-小鼠中,rtg的作用消失,xe991僅抑制了剩余電流的11.8±4.3%。(3)在穩(wěn)定表達(dá)kv7.4鉀通道的cho細(xì)胞和腦片vta區(qū)da能神經(jīng)元中,法舒地爾(fasudil)(0.1,1,10,30,100μm)選擇性濃度依賴地增加kv7.4電流,ec50分別為14.2±0.6μm和16.8±1.1μm,應(yīng)用3μmxe991可逆轉(zhuǎn)上述作用;在kv7.4-/-小鼠中,法舒地爾無(wú)上述作用;法舒地爾不激活kv7.2及kv7.2/kv7.3通道。(4)在野生型小鼠的vta區(qū)da能神經(jīng)元中,3μmxe991和10μm法舒地爾分別使神經(jīng)元膜電位從-65.3±3.1mv和-66.6±3.6mv改變至-62.9±3.0mv和-72.4±4.0mv(p0.01,p0.001);kv7.4-/-小鼠中未見上述作用。(5)10μm法舒地爾明顯降低去極化電流誘發(fā)的vta區(qū)da能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏谋l(fā)次數(shù),而在kv7.4-/-小鼠中,10μm法舒地爾對(duì)誘發(fā)的放電無(wú)顯著影響;200pa去極化電流在野生型和kv7.4-/-小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元中分別誘發(fā)13.0±1.7和21.6±2.9個(gè)動(dòng)作電位(p0.05)。(6)在全細(xì)胞和“松弛”細(xì)胞貼附式記錄模式下,法舒地爾分別使自發(fā)放電頻率由1.5±0.3hz和1.7±0.3hz降低至0.6±0.2hz和0.8±0.3hz(p0.05,p0.01);法舒地爾在kv7.4-/-小鼠中無(wú)上述作用。野生型與kv7.4-/-小鼠的vta區(qū)da能神經(jīng)元的平均放電頻率分別為1.7±0.3hz和3.6±0.6hz,二者具有顯著性差異(p0.05)。結(jié)論:(1)kv7.4高度表達(dá)于vta邊側(cè)和部分黑質(zhì)致密部的th免疫陽(yáng)性神經(jīng)元中。(2)法舒地爾選擇性激活kv7.4通道;kv7.4是構(gòu)成vta區(qū)da能神經(jīng)元中kv7/m電流的主要kv7亞型。(3)法舒地爾使vta區(qū)da能神經(jīng)元的膜電位超極化,抑制誘發(fā)的放電和自發(fā)放電;法舒地爾的上述作用由kv7.4介導(dǎo)。選擇性激活kv7.4通道對(duì)vta區(qū)da能神經(jīng)元的興奮性具有顯著的抑制作用。第二部分kv7.4通道在多巴胺調(diào)節(jié)vta區(qū)da能神經(jīng)元興奮性中的作用及與動(dòng)物抑郁樣行為的關(guān)系目的:研究kv7.4通道參與多巴胺調(diào)節(jié)vta區(qū)da能神經(jīng)元自發(fā)放電的過(guò)程及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,并觀察kv7.4通道與動(dòng)物抑郁樣行為的關(guān)系。方法:利用離體腦片全細(xì)胞、貼附式膜片鉗技術(shù)和kv7.4基因敲除小鼠,觀察kv7.4通道在多巴胺增大vta區(qū)da能神經(jīng)元kv7/m電流以及抑制興奮性中的作用;建立小鼠慢性社交失敗抑郁癥模型,利用上述電生理技術(shù),觀察抑郁模型小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元上kv7.4鉀通道對(duì)放電活動(dòng)的影響。結(jié)果:(1)在野生型小鼠中,20μm和100μm多巴胺分別使vta區(qū)da能神經(jīng)元kv7/m電流增大42%和53%,這一作用可被3μmxe991逆轉(zhuǎn);在kv7.4-/-小鼠,100μm多巴胺僅使kv7/m電流增加14%。(2)20μm多巴胺使膜電位從-65.3±2.9mv超極化至-75.9±2.1mv(p0.01),這一作用可被3μmxe991逆轉(zhuǎn)。多巴胺使野生型(提前給予3μmxe991)和kv7.4-/-小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元的靜息膜電位分別改變2.5±2.0mv和2.9±1.2mv,二者無(wú)顯著性差異(p0.05)。(3)多巴胺使野生型和kv7.4-/-小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元的平均放電頻率由1.9±0.3hz和2.5±0.3hz降低至0.6±0.2hz和1.7±0.4hz(p0.01,p0.05),抑制率分別為62.1±11.3%和39.1±10.3%(p0.001)。(4)vta區(qū)da能神經(jīng)元對(duì)xe991有不同反應(yīng),依此分為兩類:kv7依賴的神經(jīng)元(73%)和非kv7依賴的神經(jīng)元(27%)。在kv7依賴的神經(jīng)元中,xe991阻斷了多巴胺降低放電頻率的作用,而在非kv7依賴的神經(jīng)元中xe991無(wú)此作用。(5)d2受體阻斷劑sulpiride(300nm)、gi/o蛋白阻斷劑pertusistoxin(ptx,500ng/ml)和還原劑dithiothreitol(dtt,1mm)可以抑制多巴胺增大kv7/m樣電流的作用,而d1受體阻斷劑sch23390(1μm)無(wú)上述作用;d2受體阻斷劑sulpiride還抑制多巴胺引起的膜電位超極化和抑制放電作用。(6)與對(duì)照組和非敏感型小鼠相比,對(duì)社交挫敗刺激敏感小鼠的vta區(qū)da能神經(jīng)元上xe991敏感的kv7/m電流幅度明顯降低。(7)多巴胺顯著降低正常小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元放電頻率,而在社交挫敗敏感型小鼠的vta區(qū)da能神經(jīng)元上,上述作用消失。在正常和敏感型小鼠中,法舒地爾降低vta區(qū)da能神經(jīng)元放電,抑制率分別為42.2±13.5%和31.6±12.2%(p0.05)。結(jié)論:(1)kv7.4通道參與調(diào)控多巴胺抑制vta區(qū)da能神經(jīng)元自發(fā)放電的過(guò)程,這一作用依賴于多巴胺d2受體和gi/o蛋白,并與氧化還原機(jī)制有關(guān)。(2)在vta區(qū)域,73%da能神經(jīng)元為kv7依賴神經(jīng)元,多巴胺通過(guò)kv7.4通道調(diào)節(jié)vta區(qū)da能神經(jīng)元自發(fā)放電;27%非kv7依賴神經(jīng)元?jiǎng)t通過(guò)其他機(jī)制調(diào)節(jié)神經(jīng)元放電。(3)在社交挫敗抑郁模型小鼠中,vta區(qū)da能神經(jīng)元上kv7.4通道功能明顯降低。(4)多巴胺不能抑制社交挫敗敏感型小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元的自發(fā)發(fā)電;法舒地爾可降低正常和社交挫敗敏感型小鼠vta區(qū)da能神經(jīng)元的自發(fā)放電。第三部分a型鉀通道對(duì)vta區(qū)da能神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)及生理意義目的:比較a型鉀通道和kv7通道、sk通道及girk通道對(duì)vta區(qū)da能神經(jīng)元興奮性的作用特點(diǎn),并觀察a型鉀通道對(duì)谷氨酸受體介導(dǎo)的電活動(dòng)的影響,方法:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)、貼附式膜片鉗技術(shù)和行為學(xué)檢測(cè),觀察a型鉀通道對(duì)vta區(qū)da能神經(jīng)元靜息膜電位和自發(fā)放電頻率的調(diào)節(jié),以及a型鉀通道調(diào)節(jié)電活動(dòng)的作用與谷氨酸受體之間的關(guān)系。結(jié)果:(1)與對(duì)照組小鼠相比,社交挫敗非敏感型小鼠的瞬時(shí)外向電流顯著上調(diào)(p0.05);敏感小鼠的瞬時(shí)外向電流也略有增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(2)免疫熒光結(jié)果顯示,kv7.4集中分布在vta外側(cè)和部分黑質(zhì)致密部;sk3通道集中高表達(dá)在vta近中線部;kv7.2陽(yáng)性神經(jīng)元分布于黑質(zhì)致密部和vta外側(cè)及網(wǎng)狀部;kv4.3通道廣泛分布在vta和黑質(zhì);kv7.5則彌散分布在vta和包括網(wǎng)狀部在內(nèi)的整個(gè)黑質(zhì);所有sk3和kv4.3與th共定位,kv7.2和kv7.5與th部分共定位。(3)在vta區(qū)da能神經(jīng)元上,a型鉀通道阻斷劑4-ap(2mm)、kv7/m通道阻斷劑xe991(3μm)、girk通道阻斷劑tertiapin(50nm)和鈣激活鉀通道sk3阻斷劑apamin(10nm)分別使靜息膜電位由-61.3±3.0、-65.3±3.0mv、-62.3±6.1mv、-60.2±4.2mv去極化至-55.9±2.6mv(p0.001)、-62.9±3.0(p0.01)、-58.9±6.1mv(p0.001)、-56.5±5.4mv(p0.05);分別改變5.8±1.0mv、2.4±0.7mv、3.5±0.3mv、0.93±0.04mv,xe991、tertiapin、apamin分別與4-ap相比,均具有顯著性差異(p0.05,p0.05,p0.001)。(4)4-ap、xe991、tertiapin、apamin使vta區(qū)da能神經(jīng)元的放電頻率由1.8±0.2hz、1.9±0.3hz、1.6±0.2hz、1.3±0.3hz增加至2.8±0.3hz(p0.01)、2.1±0.3hz(p0.05)、1.8±0.2hz(p0.05)、1.6±0.3hz(p0.05);增加率分別為65.8±14.1%、13.9±5.5%、16.9±5.9%、41.7±23.2%,xe991、tertiapin分別與4-ap相比,均具有顯著性差異(p0.01,p0.01)。(5)在nmda(20μm)作用下,4-ap使神經(jīng)元平均放電頻率由1.7±0.3hz增加至2.1±0.4hz(p0.05);在picrotoxin(gabaa受體阻斷劑,100μm)+kynurenicacid(離子型谷氨酸受體阻斷劑,100μm)作用下,4-ap沒(méi)能改變放電頻率(由2.0±0.4hz變?yōu)?.3±1.3hz,p0.05);在picrotoxin+CNQX(AMPA/kainate谷氨酸受體阻斷劑,12.5μM)+NMDA作用下,4-AP使放電頻率由4.0±0.8 Hz增加至5.0±1.1 Hz(P0.05)。(6)在NMDA(20μM)作用下,4-AP使動(dòng)作電位峰峰間期變異系數(shù)(CV-ISI)由0.4±0.08增加至0.6±0.1(P0.05);在Picrotoxin(100μM)+kynurenic acid(100μM)作用下,4-AP沒(méi)有影響CV-ISI(由0.5±0.1變?yōu)?.5±0.06,P0.05);在Picrotoxin(100μM)+CNQX(12.5μM)+NMDA作用下,4-AP使CV-ISI由0.6±0.1增加至0.8±0.3(P0.05)。結(jié)論:(1)Kv4.3通道廣泛表達(dá)在VTA與黑質(zhì),與TH免疫陽(yáng)性(多巴胺)神經(jīng)元共定位;(2)靜息狀態(tài)下,A型鉀通道調(diào)節(jié)VTA區(qū)DA能神經(jīng)元靜息膜電位和自發(fā)放電頻率;阻斷NMDA受體可能會(huì)抑制A型鉀通道調(diào)節(jié)自發(fā)放電的作用;而當(dāng)NMDA受體激活時(shí),A型鉀通道可干擾神經(jīng)元放電的規(guī)律性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 任盼;劉志強(qiáng);任維;;單次可卡因注射對(duì)VTA區(qū)DA神經(jīng)元興奮性突觸傳遞和內(nèi)在興奮性的影響[J];中國(guó)藥物依賴性雜志;2012年03期

2 張穎麗,汪海;神經(jīng)元ATP敏感鉀通道的研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2003年07期

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本文編號(hào)：1475694