本文關鍵詞： tau 線粒體 分裂 融合 退行性變 阿爾茨海默病　出處：《華中科技大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：Tau蛋白既是組裝微管和維持微管穩(wěn)定性的重要骨架蛋白，也是AD腦內神經元纖維纏結的重要組分。最近研究發(fā)現AD患者或AD樣動物大腦神經元有顯著的線粒體形態(tài)分布異常和功能障礙。曾有研究報道被半胱天冬酶酶切后的tau在神經元可引起線粒體碎裂；AD病人神經元突觸線粒體內富含N端截斷tau蛋白且與突觸病變和細胞器損傷相關。但是，AD腦內也存在全長tau蛋白，而tau蛋白是否影響線粒體動態(tài)，且其在細胞及神經退變中是否起作用未有研究報道。 目的：探討人全長tau（htau）蛋白對細胞的線粒體分裂融合動態(tài)的影響及其在神經元退變中的作用。本研究在HEK293細胞、大鼠原代海馬神經元、htau轉基因動物水平進行了研究，旨在闡明過度表達tau蛋白對線粒體分裂、融合動態(tài)，線粒體功能，及其對細胞突起退變的影響及其機制。 方法：首先采用轉染標記線粒體的質粒進行激光共聚焦成像技術結合線粒體形態(tài)分布定量分析，在HEK293細胞檢測了穩(wěn)定或瞬時htau過度表達對線粒體形狀、分布的影響；采用ZEISS510激光共聚焦實時動態(tài)成像觀測htau過度表達對細胞內線粒體分裂、融合動態(tài)，及細胞突起變化。使用免疫印跡、熒光定量PCR檢測了細胞及動物過表達htau對線粒體分裂融合蛋白及mRNA水平的影響。給予放線菌酮抑制mRNA合成來證實tau蛋白是否通過影響Mfns的泛素化降解引起融合蛋白水平升高。進一步通過免疫印跡實驗檢測了tau過度表達對Mfns的泛素化修飾的影響。酶活性測定檢測了tau過度表達時蛋白酶小體活性及Complex I活性的變化。測定了tau過度表達對細胞內ATP水平的影響。采用JC-1染色分析細胞內線粒體膜電位。分離線粒體檢測了細胞及動物tau過度表達對線粒體PINK1水平的影響。采用堿或胰酶處理純化的線粒體來檢測tau蛋白是否分布在線粒體。 結果：在本實驗中我們觀察到以下結果：（1） htau穩(wěn)定或瞬時過度表達引起大量HEK293細胞和大鼠原代海馬神經元出現線粒體形態(tài)和分布障礙，表現為線粒體延長并聚集在細胞核周圍，細胞突起部位分布的線粒體數目顯著減少；(2)穩(wěn)定或過度表達htau蛋白引起HEK293細胞線粒體融合速度顯著加快；（3）htau過度表達引起HEK293細胞及小鼠海馬線粒體融合蛋白水平Mfn1、Mfn2和OPA1水平顯著升高;(4)下調融合蛋白Mfn1和Mfn2可部分逆轉穩(wěn)定表達htau的HEK293細胞的線粒體形態(tài)和分布障礙;(5)熒光定量PCR發(fā)現Mfn2mRNA水平升高；蛋白酶小體活性下降；抑制mRNA合成后， Mfn2水平高于對照組；（6）證明鼠tau蛋白可作為一個完整的膜蛋白定位于線粒體內膜，htau蛋白定位于線粒體膜間隙或靠近內膜處；（7）發(fā)現htau蛋白過度表達升高線粒體基礎膜電位，PINK1水平顯著下降；（8）發(fā)現在HEK293細胞htau過度表達早期不影響線粒體Complex I活性及ATP水平，晚期使二者下降，，htau轉基因動物內Complex I活性降低；（9）htau穩(wěn)定過度表達或瞬時表達48h引起HEK293細胞出現退行性變化，突起變短變細，或出現腫脹、斷裂等變化；（10）發(fā)現htau過度表達48h引起原代海馬神經元的線粒體聚集在核周圍或短樹突內，突起內線粒體密度顯著降低，突起數目顯著減少，軸突長度顯著縮短，突起出現串珠樣斷裂等退行性變化。 結論：htau過度表達早期引起線粒體融合加速、聚集在細胞核周圍，晚期引起線粒體呼吸酶Comlex I活性降低和ATP生成減少，使細胞出現退行性改變。htau分布在線粒體升高線粒體基礎膜電位，抑制PINK1轉位于線粒體，使融合蛋白Mfns泛素化降解障礙，從而導致線粒體動態(tài)改變的機制。
[Abstract]:Tau protein is an important skeleton protein to assemble the microtubules and maintain the stability of the microtubules . It is also an important component of the entanglement of the neurons in AD . Recent studies have found that the brain neurons of AD patients or AD - like animals have significant abnormal mitochondrial morphology and dysfunction . There is a study that the tau protein is rich in N - terminal truncated tau protein in the synaptic mitochondria of AD patients and is associated with synaptic lesions and organelle damage . However , there is also a full - length tau protein in AD brain , and whether tau protein affects the dynamics of mitochondria and whether it plays a role in the cell and neurodegeneration . Objective : To investigate the effect of human full - length tau ( htau ) protein on mitochondrial DNA fragmentation and its role in neuronal degeneration . Methods : The effect of the overexpression of htau on the mitochondrial membrane protein and mRNA level of the mitochondria was detected by using the plasmid of the transfection marker mitochondria . The effect of the overexpression of htau on the mitochondrial membrane protein and mRNA level in the cells was investigated by using the fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( PCR ) . The effects of the overexpression of htau on the mitochondrial membrane protein and mRNA level in the cells were investigated by using the method of Western blot . Results : In this experiment , we observed the following results : ( 1 ) the stable or transient overexpression of htau resulted in a significant decrease in mitochondrial morphology and distribution in the neurons of the hippocampus and in the rat primary hippocampal neurons . Conclusion : In the early stage of htau overexpression , mitochondrial fusion was accelerated , and the activity of mitochondrial respiratory enzymes Comlex I was decreased and ATP formation was decreased in the late stage .

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

【共引文獻】

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本文編號：1473287