本文關(guān)鍵詞： tau 線粒體 分裂 融合 退行性變 阿爾茨海默病　出處：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Tau蛋白既是組裝微管和維持微管穩(wěn)定性的重要骨架蛋白，也是AD腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)的重要組分。最近研究發(fā)現(xiàn)AD患者或AD樣動物大腦神經(jīng)元有顯著的線粒體形態(tài)分布異常和功能障礙。曾有研究報(bào)道被半胱天冬酶酶切后的tau在神經(jīng)元可引起線粒體碎裂；AD病人神經(jīng)元突觸線粒體內(nèi)富含N端截?cái)鄑au蛋白且與突觸病變和細(xì)胞器損傷相關(guān)。但是，AD腦內(nèi)也存在全長tau蛋白，而tau蛋白是否影響線粒體動態(tài)，且其在細(xì)胞及神經(jīng)退變中是否起作用未有研究報(bào)道。 目的：探討人全長tau（htau）蛋白對細(xì)胞的線粒體分裂融合動態(tài)的影響及其在神經(jīng)元退變中的作用。本研究在HEK293細(xì)胞、大鼠原代海馬神經(jīng)元、htau轉(zhuǎn)基因動物水平進(jìn)行了研究，旨在闡明過度表達(dá)tau蛋白對線粒體分裂、融合動態(tài)，線粒體功能，及其對細(xì)胞突起退變的影響及其機(jī)制。 方法：首先采用轉(zhuǎn)染標(biāo)記線粒體的質(zhì)粒進(jìn)行激光共聚焦成像技術(shù)結(jié)合線粒體形態(tài)分布定量分析，在HEK293細(xì)胞檢測了穩(wěn)定或瞬時(shí)htau過度表達(dá)對線粒體形狀、分布的影響；采用ZEISS510激光共聚焦實(shí)時(shí)動態(tài)成像觀測htau過度表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)線粒體分裂、融合動態(tài)，及細(xì)胞突起變化。使用免疫印跡、熒光定量PCR檢測了細(xì)胞及動物過表達(dá)htau對線粒體分裂融合蛋白及mRNA水平的影響。給予放線菌酮抑制mRNA合成來證實(shí)tau蛋白是否通過影響Mfns的泛素化降解引起融合蛋白水平升高。進(jìn)一步通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測了tau過度表達(dá)對Mfns的泛素化修飾的影響。酶活性測定檢測了tau過度表達(dá)時(shí)蛋白酶小體活性及Complex I活性的變化。測定了tau過度表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響。采用JC-1染色分析細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位。分離線粒體檢測了細(xì)胞及動物tau過度表達(dá)對線粒體PINK1水平的影響。采用堿或胰酶處理純化的線粒體來檢測tau蛋白是否分布在線粒體。 結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到以下結(jié)果：（1） htau穩(wěn)定或瞬時(shí)過度表達(dá)引起大量HEK293細(xì)胞和大鼠原代海馬神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體形態(tài)和分布障礙，表現(xiàn)為線粒體延長并聚集在細(xì)胞核周圍，細(xì)胞突起部位分布的線粒體數(shù)目顯著減少；(2)穩(wěn)定或過度表達(dá)htau蛋白引起HEK293細(xì)胞線粒體融合速度顯著加快；（3）htau過度表達(dá)引起HEK293細(xì)胞及小鼠海馬線粒體融合蛋白水平Mfn1、Mfn2和OPA1水平顯著升高;(4)下調(diào)融合蛋白Mfn1和Mfn2可部分逆轉(zhuǎn)穩(wěn)定表達(dá)htau的HEK293細(xì)胞的線粒體形態(tài)和分布障礙;(5)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)Mfn2mRNA水平升高；蛋白酶小體活性下降；抑制mRNA合成后， Mfn2水平高于對照組；（6）證明鼠tau蛋白可作為一個(gè)完整的膜蛋白定位于線粒體內(nèi)膜，htau蛋白定位于線粒體膜間隙或靠近內(nèi)膜處；（7）發(fā)現(xiàn)htau蛋白過度表達(dá)升高線粒體基礎(chǔ)膜電位，PINK1水平顯著下降；（8）發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞htau過度表達(dá)早期不影響線粒體Complex I活性及ATP水平，晚期使二者下降，，htau轉(zhuǎn)基因動物內(nèi)Complex I活性降低；（9）htau穩(wěn)定過度表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)48h引起HEK293細(xì)胞出現(xiàn)退行性變化，突起變短變細(xì)，或出現(xiàn)腫脹、斷裂等變化；（10）發(fā)現(xiàn)htau過度表達(dá)48h引起原代海馬神經(jīng)元的線粒體聚集在核周圍或短樹突內(nèi)，突起內(nèi)線粒體密度顯著降低，突起數(shù)目顯著減少，軸突長度顯著縮短，突起出現(xiàn)串珠樣斷裂等退行性變化。 結(jié)論：htau過度表達(dá)早期引起線粒體融合加速、聚集在細(xì)胞核周圍，晚期引起線粒體呼吸酶Comlex I活性降低和ATP生成減少，使細(xì)胞出現(xiàn)退行性改變。htau分布在線粒體升高線粒體基礎(chǔ)膜電位，抑制PINK1轉(zhuǎn)位于線粒體，使融合蛋白Mfns泛素化降解障礙，從而導(dǎo)致線粒體動態(tài)改變的機(jī)制。
[Abstract]:Tau protein is an important skeleton protein to assemble the microtubules and maintain the stability of the microtubules . It is also an important component of the entanglement of the neurons in AD . Recent studies have found that the brain neurons of AD patients or AD - like animals have significant abnormal mitochondrial morphology and dysfunction . There is a study that the tau protein is rich in N - terminal truncated tau protein in the synaptic mitochondria of AD patients and is associated with synaptic lesions and organelle damage . However , there is also a full - length tau protein in AD brain , and whether tau protein affects the dynamics of mitochondria and whether it plays a role in the cell and neurodegeneration . Objective : To investigate the effect of human full - length tau ( htau ) protein on mitochondrial DNA fragmentation and its role in neuronal degeneration . Methods : The effect of the overexpression of htau on the mitochondrial membrane protein and mRNA level of the mitochondria was detected by using the plasmid of the transfection marker mitochondria . The effect of the overexpression of htau on the mitochondrial membrane protein and mRNA level in the cells was investigated by using the fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( PCR ) . The effects of the overexpression of htau on the mitochondrial membrane protein and mRNA level in the cells were investigated by using the method of Western blot . Results : In this experiment , we observed the following results : ( 1 ) the stable or transient overexpression of htau resulted in a significant decrease in mitochondrial morphology and distribution in the neurons of the hippocampus and in the rat primary hippocampal neurons . Conclusion : In the early stage of htau overexpression , mitochondrial fusion was accelerated , and the activity of mitochondrial respiratory enzymes Comlex I was decreased and ATP formation was decreased in the late stage .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1473287