發(fā)布時(shí)間：2018-01-06 06:28

  本文關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)胰島素信號通路功能障礙及其機(jī)制的研究　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景：我國現(xiàn)約有阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)患者569萬人,在大于65歲老年人中總患病率約3.5%。該病嚴(yán)重危害老年人的身心健康,降低患者及其家屬的生活質(zhì)量。全球用于AD治療及照料的年支出達(dá)6000億美元。AD給社會和家庭帶來極大的負(fù)擔(dān),是一種對患者及社會均將產(chǎn)生極大危害的疾病。對AD的發(fā)病及診療進(jìn)行研究具有極其重要的意義。AD主要臨床表現(xiàn)為以近記憶減退為首發(fā)癥狀的認(rèn)知障礙、行為損害、精神異常,并可伴有日常生活能力受損；其病理變化以β-淀粉樣蛋白沉積(Amyloid-beta, Aβ)、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)、以及神經(jīng)元丟失為特征。傳統(tǒng)AD的發(fā)病機(jī)制研究主要集中于遺傳因素、β淀粉樣蛋白級聯(lián)假說、膽堿能假說、炎癥損害、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)、能量代謝障礙、胰島素信號通路功能障礙、興奮性毒性、血管因素等方面。其中,ERS及胰島素信號通路功能障礙是目前研究的熱點(diǎn)。既往研究表明,在脂肪細(xì)胞中,ERS下游激酶c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)的激活可導(dǎo)致胰島素受體底物-1 (Insulin receptor substance-1, IRS-1)絲氨酸磷酸化,從而引起胰島素信號通路功能障礙,引起脂肪細(xì)胞胰島素抵抗。在肝臟、骨骼肌中有類似結(jié)果。但在AD中,是否存在ERS通過某種機(jī)制影響胰島素信號通路仍不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、加工及修飾的場所,大量未折疊及錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集將會引起ERS。ERS發(fā)生時(shí),結(jié)合免疫球蛋白蛋白(Binding Immunoglobulin protein, BiP)將與肌醇需求酶la (Inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)、雙鏈RNA激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Double strandedRNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、轉(zhuǎn)錄激活因子6 (Activating transcription factor 6, ATF6)解離,引起下游通路的激活。早期ERS通常可通過提高蛋白降解、促進(jìn)分子伴侶表達(dá)、抑制蛋白合成等緩解負(fù)荷,但如果ERS持續(xù)存在或過強(qiáng),將會引起細(xì)胞凋亡。神經(jīng)元作為有絲分裂后細(xì)胞,因不能依賴分裂緩沖應(yīng)激壓力,所以極易發(fā)生ERS=AD患者尸檢資料證實(shí)存在ERS的證據(jù)。AD患者大腦BiP表達(dá)升高并且與Ap沉積相關(guān),PERK磷酸化增加且與Tau蛋白過磷酸化共定位,海馬區(qū)IRE1α磷酸化以及顳葉X-盒-結(jié)合蛋白1 (X-box binding protein1, XBP1) mRNA剪切增加等。研究表明,Aβ寡聚體處理原代神經(jīng)元細(xì)胞可引起ERS標(biāo)志物的改變,如BiP表達(dá)升高、PERK磷酸化增加、XBP1 mRNA剪切增加以及C/EBP同源蛋白(CEBP homology protein, CHOP)表達(dá)增加等。作為ERS的下游激酶,JNK在AD的發(fā)病中也起著重要作用。在AD患者尸檢資料中,JNK磷酸化水平升高并且和Aβ共定位。AD轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬組織中磷酸化JNK升高。Aβ寡聚體處理的類神經(jīng)元細(xì)胞及原代神經(jīng)元均可出現(xiàn)JNK的磷酸化水平升高。腹腔注射JNK抑制劑可改善AD轉(zhuǎn)基因動物行為學(xué)表現(xiàn)。JNK3敲除小鼠可出現(xiàn)Aβ1-42水平下降、Ap沉積減少、神經(jīng)元數(shù)量增加及認(rèn)知的改善。胰島素信號通路廣泛分布于全身各種組織,是維持機(jī)體正常生理功能不可或缺的重要傳導(dǎo)通路。胰島素受體為酪氨酸偶聯(lián)膜受體,當(dāng)胰島素與胰島素受體α亞基結(jié)合時(shí),胰島素受體p亞基發(fā)生自體酪氨酸磷酸化,胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸激酶活性上升,引起IRS-1酪氨酸磷酸化。IRS-1繼而招募下游磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K),依次導(dǎo)致下游蛋白激酶B (Protein kinase B, PKB/Akt)及糖原合成酶激酶3β (Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)激活,以上諸酶聯(lián)合構(gòu)成胰島素PI3K/Akt信號通路。在絕大多數(shù)關(guān)于胰島素信號通路功能障礙的研究中,IRS-1都是關(guān)鍵分子。胰島素與胰島素受體結(jié)合引起IRS-1的酪氨酸磷酸化,從而使信號下傳。大多數(shù)位點(diǎn)的IRS-1絲氨酸磷酸化則可引起IRS-1與胰島素受體及下游P13K脫離、IRS-I酪氨酸磷酸化降低,從而抑制胰島素信號通路下傳。IRS-1絲氨酸磷酸化與酪氨酸磷酸化的復(fù)雜平衡介導(dǎo)著胰島素信號通路的狀態(tài)。有研究顯示,多種激酶可導(dǎo)致IRS-1的絲氨酸磷酸化,ERS的下游激酶JNK是其中之一。JNK激活可影響IRS-1307、318及612位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化。JNK可作為關(guān)鍵分子,連接ERS及胰島素信號通路障礙。在涉及學(xué)習(xí)記憶過程的研究中,胰島素信號通路處于極為重要的地位。研究表明腦中胰島素受體在認(rèn)知敏感區(qū)域分布密度高,如海馬、杏仁核、內(nèi)側(cè)顳葉等。經(jīng)空間記憶訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)動物,海馬區(qū)胰島素受體敏感性升高,其表達(dá)水平、轉(zhuǎn)位及酪氨酸磷酸化狀態(tài)均發(fā)生改變,而特異性阻斷海馬區(qū)胰島素受體會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物記憶處理障礙。自1994年Hoyer S首次提出胰島素信號通路功能障礙作為AD的發(fā)病機(jī)制起,AD中胰島素信號通路的改變及其作用逐漸成為研究的焦點(diǎn)。胰島素信號通路與Ap的產(chǎn)生及清除、神經(jīng)發(fā)生、Tau蛋白過磷酸化、能量代謝及突觸功能有關(guān)。Ap寡聚體處理原代神經(jīng)元中,有IRS-1307,612位點(diǎn)絲氨酸磷酸化升高的報(bào)道。在AD轉(zhuǎn)基因動物模型3xTg小鼠IRS-1的612位點(diǎn)絲氨酸磷酸化升高。AD患者尸檢顯示IRS-1的312、616、636(相當(dāng)于嚙齒類307、612、632)位點(diǎn)絲氨酸磷酸化升高以及其下游Akt磷酸化改變。同時(shí),IRS-1616位點(diǎn)絲氨酸磷酸化升高且與神經(jīng)元纖維纏結(jié)共定位。以上說明在AD中,IRS-1絲氨酸磷酸化修飾為胰島信號通路功能障礙的重要機(jī)制。ERS作為AD的早期事件,能夠引起下游激酶JNK激活。JNK激活可以介導(dǎo)IRS-1的絲氨酸磷酸化修飾。IRS-1為胰島素信號通路中的關(guān)鍵分子,其絲氨酸磷酸化修飾可導(dǎo)致胰島素信號通路功能障礙。ERS、JNK激活以及胰島素信號通路功能障礙在AD的發(fā)病中均有重要意義。前期,我們在9月齡AD轉(zhuǎn)基因小鼠APP/PS1中證實(shí)存在ERS,JNK激活以及IRS-1絲氨酸磷酸化。因此,我們提出假設(shè),ERS可導(dǎo)致胰島素信號通路功能障礙,其可能的機(jī)制為ERS引起的JNK依賴性的IRS-1307、318、612位點(diǎn)絲氨酸磷酸化。高分化PC12細(xì)胞作為類神經(jīng)元細(xì)胞,經(jīng)常被用于AD研究。為進(jìn)‘步驗(yàn)證假說,我們采用來源自Wistar大鼠新生鼠的皮層原代神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。Aβ1-42寡聚體在AD腦內(nèi)最具有神經(jīng)元毒性,Ap1-42寡聚體干預(yù)類神經(jīng)元或者原代神經(jīng)元為AD細(xì)胞模型造模的首選方法。APP/PS1小鼠插入了人鼠淀粉樣前體蛋白Swedish突變以及人類早老素第9個(gè)外顯子缺失突變的融合體,源于Jackson實(shí)驗(yàn)室,為公認(rèn)的AD轉(zhuǎn)基因動物模型。ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(Thapsigargin, TG)、ERS印制劑4-苯基丁酸鈉(4-phenyl butyric acid sodium, PBA)以及JNK抑制劑SP600125均為公認(rèn)的誘導(dǎo)劑及抑制劑,且PBA及SP600125可跨過血腦屏障。為驗(yàn)證假說,我們采用Aβ1-42寡聚體處理的PC12細(xì)胞、皮層原代神經(jīng)元以及AD轉(zhuǎn)基因動物模型為研究對象,借助ERS誘導(dǎo)劑、ERS抑制劑及JNK抑制劑開展實(shí)驗(yàn)。研究目的：1、驗(yàn)證在AD細(xì)胞模型及AD轉(zhuǎn)基因動物模型中是否存在ERS及胰島素信號通路功能障礙。2、明確在AD細(xì)胞模型及AD轉(zhuǎn)基因動物模型中ERS是否可引起胰島素信號通路功能障礙。3、探討在AD細(xì)胞模型及AD轉(zhuǎn)基因動物模型中ERS引起胰島素信號通路功能障礙的機(jī)制。研究方法：1、體外實(shí)驗(yàn)：高分化大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)培養(yǎng)：購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(目錄號：TCR9),置于37℃C、含有5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,使用添加10%胎牛血清以及100 U／ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)。按照實(shí)驗(yàn)需求對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代、凍存、干預(yù)處理及蛋白收集等操作。皮層原代神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定：取新生1天內(nèi)Wistar大鼠乳鼠(購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)皮層組織,按照步驟分離神經(jīng)元,置于37℃、含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,使用添加有2%無血清B27、0.5%L-谷氨酰胺以及100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的Neurobasal A培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)10天的皮層原代神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。采用MAP2及GFAP免疫熒光染色方法對神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：AD轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)及鑒定：AD轉(zhuǎn)基因小鼠及相應(yīng)野生型(Wild type, WT)小鼠購自南京大學(xué)南京模式動物研究中心(來源自Jackson實(shí)驗(yàn)室)。AD轉(zhuǎn)基因小鼠品系名稱為B6C3-Tg (APPswe, PSEN1 dE9) 85Dbo/Mm JNju,簡稱APP/PS1。飼養(yǎng)室環(huán)境溫度控制在22±3℃,相對濕度60%,光線自動控制,明(07：00-19：00)暗(19：00-07：00)交替。小鼠飼養(yǎng)按照SPF動物飼養(yǎng)規(guī)范進(jìn)行。繁殖后代小鼠在1月時(shí)取鼠尾尖DNA進(jìn)行基因型鑒定。9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行Ap免疫組化染色證實(shí)皮層有大量Aβ沉積,并有明顯水迷宮行為學(xué)改變,符合實(shí)驗(yàn)需要。APP/PS1及WT小鼠行為學(xué)檢測：采用Morris水迷宮對不同干預(yù)的WT及APP/PS1小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。全過程包含1天適應(yīng)期(沒有平臺),連續(xù)5天進(jìn)行的定位航行實(shí)驗(yàn)和1天空間探索實(shí)驗(yàn)。3、 Aβ1-42寡聚體的制備與鑒定：制備主要按照Rochester醫(yī)學(xué)中心的William J.Bowers教授的方法進(jìn)行。Aβ1-42寡聚體制備后,采用透射電鏡進(jìn)行鑒定,確定寡聚體形成后保存于-80℃。使用時(shí)采用無血清培養(yǎng)基稀釋至合適濃度。采用CCK-8檢測不同處理?xiàng)l件導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。4、蛋白表達(dá)及磷酸化改變的檢測：采用western blotting檢測不同處理?xiàng)l件下PC12細(xì)胞、原代神經(jīng)元、WT及APP/PS1、鼠蛋白表達(dá)及磷酸化改變。包括：①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物：BiP, CHOP;② JNK激活：t-JNK, p-JNK Thr183/Tyr185;③胰島素信號通路功重要分子：t-IRS-1, p-IRS-1 Ser307, p-IRS-1 Ser318, p-IRS-1 Ser612, t-Akt, p-AktSer473;④AD病理改變：t-Tau, p-Tau Thr181。5、ERS相關(guān)基因mRNA水平的改變：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同處理?xiàng)l件下PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因mRNA水平改變,包括：BiP、CHOP、ATF4、GADD34、Nrf2、PUMA、TRB3、 XBP1slXBP1u。采用RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測XBP1剪切。6、 統(tǒng)計(jì)分析：定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,取p值小于0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。研究結(jié)果：1、Aβ1-42寡聚體增加PC12細(xì)胞IRS-1絲氨酸磷酸化為檢測胰島索信號通路功能狀態(tài),需要使用基礎(chǔ)水平胰島素刺激,首先進(jìn)行胰島素濃度梯度實(shí)驗(yàn)。PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度的胰島素(0,25,50,100以及200nM)處理30 min后,p-IRS-1 Ser30、p-IRS-1Ser318及p-IRS-1Ser612位點(diǎn)絲氨酸磷酸化呈現(xiàn)濃度依賴性升高。在25 nM胰島素作用30 min后,p-Akt Ser473磷酸化升高,與空白對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而p-IRS-1 Ser30、 p-IRS-1Ser318及p-IRS-1Ser612并未顯著升高。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇了25nM作為PC12細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素濃度。參考既往研究,原代神經(jīng)元的基礎(chǔ)胰島素濃度為1nM。為選擇合適的Aβ1-42寡聚體處理?xiàng)l件,進(jìn)行Aβ1-42寡聚體濃度梯度及時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)。PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度Aβ1-42寡聚體(0,0.25,0.5,0.75,1以及2 μM,處理時(shí)間為120 min)及不同時(shí)間(0,15,30,60,120以及240 min,處理濃度為1μM)處理后(在收蛋白之前30 min添加濃度為25 nM胰島素刺激),p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1Ser318及p-IRS-1Ser612位點(diǎn)絲氨酸磷酸化呈現(xiàn)劑量依賴性以及時(shí)間相關(guān)性升高。Ap 1-42寡聚體處理(1 μM,120 min)可顯著升高p-IRS-1 Ser30、p-IRS-1Ser318及p-IRS-1Ser612磷酸化水平(p0.05),降低p-AktSer473磷酸化水平(p0.05)。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,以1 μM和120 min作為Ap1-42寡聚體處理PC12細(xì)胞的條件參數(shù)。參考既往研究,Aβ 1-42寡聚體處理原代神經(jīng)元的條件為500 nM及3 h。2、Aβ1-42寡聚體、TG處理可誘發(fā)ERS,引起JNK激活并升高IRS-1絲氨酸磷酸化水平在PC12細(xì)胞中,Aβ 1-42寡聚體(1 μM,120 min)處理可以引起B(yǎng)iP、CHOP蛋白水平升高(p0.05), BiP、CHOP、ATF4、TRB3、PUMA、GADD34、Nrf-2 mRNA水平升高(p0.05),以及XBPl的剪切。Ap 1-42寡聚體(1μM,120 min)及ERS誘導(dǎo)劑TG (2μM,120 min)可引起p-JNK Thr183/Tyr185磷酸化水平升高(p0.05)以及p-IRS-1Ser307、p-IRS-1Ser318和p-IRS-1Ser612磷酸化水平升高(p0.05)。Aβ 1-42寡聚體(1 μM,24 h)及TG (2μM,24 h)可引起p-Tau Thr181磷酸化水平升高(p0.05)。3、APP/PS1小鼠皮層存在ERS、JNK激活及IRS-1絲氨酸磷酸化水平的升高9月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與同月齡同窩雄性WT小鼠相比,皮層BiP及CHOP表達(dá)升高(p0.05), p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1 Ser307, p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平升高(p0.05)。4、抑制ERS可降低Aβ1-42寡聚體引起的.INK激活、IRS-1絲氨酸磷酸化在皮層原代神經(jīng)元以及PC12細(xì)胞中,ERS抑制劑PBA預(yù)處理(2 mM,3h)可降低Ap1-42寡聚體處理引起的p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318、 p-IRS-1 Ser612以及p-Tau Thr181磷酸化(p0.05)。給予APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射PBA (200 mg/kg,5周)可改善水迷宮行為學(xué)表現(xiàn),并降低皮層p-JNK Thr183/Tyr185, p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p0.05)。5、抑制JNK激活可降低Aβ1-42寡聚體引起的IRS-1絲氨酸磷酸化在皮層原代神經(jīng)元以及PC12細(xì)胞中,JNK抑制劑SP600125預(yù)處理(25 μM, 40min)可降低p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318、p-IRS-1Ser612以及p-Tau Thr181磷酸化(p0.05)。給予APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射SP600125(30mg/kg,12周)可改善水迷宮行為學(xué)表現(xiàn),并降低皮層p-JNK Thr183/Tyr185、 p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p0.05)。結(jié)論：1、在Aβ1-42寡聚體處理的PC12細(xì)胞、皮層原代神經(jīng)元,APP/PS1小鼠中存在ERS及胰島素信號通路功能障礙。2、在Aβ1-42寡聚體處理的PC12細(xì)胞、皮層原代神經(jīng)元,APP/PS1小鼠中ERS可引起胰島素信號通路功能障礙。3、在Aβ1-42寡聚體處理的PC12細(xì)胞、皮層原代神經(jīng)元,APP/PS1小鼠中,ERS引起胰島素信號通路功能障礙的可能機(jī)制為JNK依賴性的IRS-1絲氨酸磷酸化。4、在Aβ1-42寡聚體處理的PC12細(xì)胞、皮層原代神經(jīng)元中,ERS/JNK/IRS-1通路的激活可引起Tau蛋白過磷酸化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
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本文編號：1386700