本文關鍵詞：TRIM32的缺失導致小鼠自閉癥樣行為的實驗研究　出處：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：自閉癥(Autism),又稱孤獨癥,是一種以嚴重的、廣泛的社會相互影響和溝通技能損害以及刻板的行為、興趣和活動為特征的遺傳性、多樣性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病,目前也被廣稱為自閉癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder, ASD)。患者常表現(xiàn)出不同程度的社交能力,語言溝通能力以及相關日常生活能力的異常,同時還伴有心理發(fā)育滯緩,智力低下,癲癇等相關癥狀,更有患者出現(xiàn)睡眠異常、多動以及注意力不集中等情況。這不僅對患者的健康、精神和生活造成極大的傷害,也給其家庭和社會帶來了許多的問題和困難。目前,自閉癥已成為一種全球性的難題之一,據(jù)統(tǒng)計,全球大約有3500萬人患有自閉癥,大約每150個人中就有1個自閉癥患者,而急速增長的發(fā)病率,讓全世界對其越發(fā)的關注,為此聯(lián)合國將每年的4月2日命名為“世界自閉癥關注日”,以提醒全世界提高對自閉癥的關注和認識。遺憾的是,目前對于自閉癥的發(fā)病原因仍不完全清楚。自閉癥患者的大腦皮層、海馬以及杏仁核存在著不同形式的發(fā)育異常,關鍵腦區(qū)神經(jīng)元異常增多,導致局部區(qū)域的神經(jīng)網(wǎng)絡過度連接；早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,神經(jīng)元遷移異常,導致神經(jīng)元異常定位：不同區(qū)域興奮-抑制性神經(jīng)元失衡,導致相應神經(jīng)網(wǎng)絡調節(jié)異常；神經(jīng)元突觸和樹突棘的異常發(fā)育導致神經(jīng)元之間信號傳導異常等都可能與自閉癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。TRIM32 (Tripartite motif 32)是一種具有E3泛素鏈接酶活性的蛋白,其蛋白結構中除了具有TRIM家族特征性的鋅指結構域、B-boxes結構域和卷曲結構域之外,還有其獨特的6個重復性的NHL結構域。先前的大量研究表明TRIM32在肌肉系統(tǒng)中有著重要的作用：TRIM32能夠調節(jié)骨骼肌干細胞的分化,TRIM32遺傳性的缺失常常導致2H型肢帶肌營養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy type 2H (LGMD2H));在癌癥領域TRIM32被廣泛的報道參與了腫瘤細胞的生長和轉移。此外,TRIM32在巴爾德-別德爾綜合征(Bardet-Biedl syndrome(BBS))中也起著重要的作用。近年來,隨著TRIM32被廣泛的關注和研究,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)領域的作用也逐漸被認識：TRIM32作為細胞命運的決定子,不僅能夠調節(jié)胚胎神經(jīng)前體細胞往神經(jīng)元方向分化,也能夠參與成年神經(jīng)前體細胞的神經(jīng)發(fā)生;而TRIM32的遺傳性丟失可以導致嗅球區(qū)神經(jīng)元的過量產(chǎn)生并最終引起嗅覺能力的損害。與此同時,許多與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關的疾病也被廣泛地和TRIM32聯(lián)系到了一起,這其中包括：阿爾茨海默病(Alzhermer's Disease, AD)、注意力缺陷多動癥(Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD)、焦慮和強迫癥(Obsessive Compulsive Disorder, OCD)等,而自閉癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder, ASD)作為一種廣泛性的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性的疾病不可避免的也被聯(lián)系到了一起。本研究中我們首先揭示了TRIM32高表達于小鼠成熟的大腦皮層神經(jīng)元以及胎腦的MGE區(qū)中間神經(jīng)前體細胞中,然后通過在TRM32基因敲除小鼠中進行自閉癥相關行為學的測試,發(fā)現(xiàn)TRIM32的遺傳性缺失導致小鼠表現(xiàn)出了自閉癥核心的社交障礙和重復刻板樣舉止。同時,γ-氨基丁酸能(GABAergic)抑制性神經(jīng)元的大量減少在TRIM32敲除的小鼠大腦皮層中被發(fā)現(xiàn)；進一步研究表明這種減少的GABAergic抑制性神經(jīng)元是由于胚胎發(fā)育過程中TRIM32的缺失導致中間神經(jīng)節(jié)隆起(Medial ganglionic eminence,MGE)區(qū)的中間神經(jīng)前體細胞增殖分裂減少所致,而這種增殖分裂減少的內在機制是由于TRIM32的缺失導致c-Myc和PI3K-Akt-mTOR等信號分子發(fā)生溶酶體自噬降解所致。此外,本研究還通過增強GABAergic神經(jīng)元突觸抑制作用的藥物氯硝西泮(Clonazepam)成功地改善了TRIM32敲除小鼠的社交行為和刻板樣行為障礙。第一章TRIM32基因在成年小鼠大腦皮層和胚胎小鼠MGE區(qū)表達情況的研究目的：研究成年小鼠大腦皮層和胚胎小鼠MGE區(qū)TRIM32的表達情況。方法：分別取材3個月齡和孕13.5天(E13.5)的野生小鼠的端腦,后放入4%的多聚甲醛中后固定,經(jīng)30%的蔗糖脫水后進行冰凍切片。取相應組織的切片進行免疫組織化學熒光染色以揭示TRIM32在兩種組織中的表達和分布情況。結果：在3月齡的小鼠大腦皮層中,TRIM32主要表達于NeuN陽性的成熟神經(jīng)元中而在GFAP陽性的星形膠質細胞和Ibal陽性的小膠質細胞中卻沒有表達；而在孕13.5天(E13.5)的胎腦中,TRIM32在MGE區(qū)高表達于Sox2陽性的中間神經(jīng)前體細胞中。結論：TRIM32在成年大腦皮層中特定表達于成熟的神經(jīng)元中但不表達于星形膠質細胞和小膠質細胞中,而在胚胎時期的MGE區(qū)高表達于中間神經(jīng)前體細胞中,這說明TRIM32可能參與了MGE區(qū)中間神經(jīng)前體細胞神經(jīng)發(fā)生方面的調控。第二章TRIM32遺傳性的缺失導致了小鼠自閉癥樣行為目的：明確TRIM32的缺失是否可以引起小鼠自閉癥樣行為。方法：采用TRIM32基因敲除(TRIM32-/-)小鼠和其同窩對照的野生(TRIM32+/+)小鼠進行自閉癥相關的行為學測試,包括社交行為(三室社交偏好實驗(3-Chamber social preference test)、雙向互動實驗(Reciprocal interaction)、少年玩耍實驗(Juvenil play)、筑巢實驗(Nest building)和刻板樣舉止(Y迷宮自發(fā)性選擇實驗(Y-maze spontaneous alternation)、自我捋毛實驗(Self-grooming))相關的實驗。結果：TRIM32-/-小鼠表現(xiàn)出了自閉癥樣的行為障礙。具體表現(xiàn)為：在3-chambers實驗中,TRIM32-/-小鼠對于在空籠子和陌生小鼠側的停留時間(time in chamber)上沒有明顯的差異(p=1.00),但是在與陌生小鼠的交流時間(interaction time)上,TRIM32-/-的小鼠明顯少于TRIM32+/+小鼠(p=0.016),雖然TRIM32-/-小鼠對于空籠子來說更加的偏好于和陌生老鼠交流(p=0.004)；進一步地,當另一只陌生小鼠被放入空籠子中的時,TRIM32-/-的小鼠對于兩側的小鼠無論在停留時間(p=0.396)還是交流時間(p=0.544)上都沒有明顯的差異。在Reciprocal interaction實驗中,TRIM32-/-的小鼠雖然在互動過程中展示出的攻擊性行為時間和野生小鼠沒有明顯的差異(p=0.113),但是表現(xiàn)出非攻擊性行為的時間卻明顯的低于野生對照的小鼠(p=0.013)。同樣地,我們用出生之后21天(P21)的TRIM32-/-小鼠和同窩對照的TRIM32+/+小鼠進行了Juvenil play實驗,結果顯示TRIM32-/-的小鼠相對于野生小鼠而言表現(xiàn)出更少的社交行為(Social) (p=0.024)而重復性的捋毛行為(Grooming)卻明顯地多于野生小鼠(p=0.033),但是在逃避性的挖掘動作(Digging)方面卻沒有明顯的區(qū)別(p=0.883)。在反映home social行為的筑巢實驗(Nest building)中,我們同樣發(fā)現(xiàn)了TRIM32-/-的小鼠有更差的表現(xiàn)(p=0.003)。此外,刻板樣舉止的檢測中,Y迷宮自發(fā)性選擇實驗和自我捋毛實驗均顯示TRIM32-/-的小鼠有更多的偏執(zhí)行為和重復動作(Y-maze spontaneous alternation test:p=0.008; Self-grooming:p =0.033)。結論：TRIM32基因敲除小鼠展示出了自閉癥樣的行為障礙。第三章TRIM32的缺失導致大腦皮層GABAergic的抑制性中間神經(jīng)元數(shù)量減少目的：探索TRIM32缺失之后小鼠大腦皮層GABAergic的抑制性中間神經(jīng)元數(shù)量的變化。方法：取出生后21天大小的TRIM32-/-小鼠和其同窩對照的野生型小鼠大腦,經(jīng)4%的多聚甲醛灌注后再后固定24小時,而后經(jīng)30%的蔗糖脫水處理之后進行冰凍切片。切片中進行小清蛋白(Parvalbumin(PV)),鈣網(wǎng)膜蛋白(Calretinin(CR)),神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y(NPY)),生長抑素(Somatostain(SST))等中間神經(jīng)元抗體的免疫熒光染色,并統(tǒng)計其在TRIM32-/-和野生小鼠大腦皮層中的數(shù)量差異。結果：在出生后21天的青年TRIM32-/-小鼠大腦皮層中,PV、CR、 NPY、 SST等蛋白陽性的中間神經(jīng)元數(shù)量較其同窩對照的野生型小鼠均是明顯降低的。(PV:p0.001; CR:p0.001;NPY:p0.001; SST:p=0.005).結論：TRIM32的缺失導致小鼠大腦皮層多種中間神經(jīng)元數(shù)量減少。第四章胚胎MGE區(qū)中間神經(jīng)前體細胞增殖的減少導致大腦皮層中間神經(jīng)元數(shù)量減少目的：探索RIM32缺失之后導致大腦皮層中間神經(jīng)元數(shù)量減少的原因和機制。方法：孕13.5天(E13.5)的TRIM32雜合(TRIM32+/-)小鼠,于處死前30min給予BrdU (50mg/kg)腹腔注射,后取胚胎TRIM32-/-小鼠及其同窩對照的野生小鼠端腦,經(jīng)固定,脫水處理后進行冰凍切片。在切片中進行BrdU免疫組織熒光染色,并統(tǒng)計MGE區(qū)Brdu陽性細胞的數(shù)量差異。此外,我們還進行pH3抗體的熒光染色,并統(tǒng)計其在兩組小鼠MGE區(qū)的數(shù)量差異。而Caspase-3抗體的染色被同樣的進行,并計數(shù)。進一步地,我們通過Western-Blotting免疫印跡的方法,還對MGE區(qū)c-Myc和PI3K-Akt-mTOR等與細胞增殖密切相關的分子和信號通路,以及與自噬溶酶體蛋白降解途徑激活相關的分子——微管相關蛋白輕鏈3(LC3)等進行了表達量的檢測。.結果：免疫熒光染色BrdU后計數(shù)顯示,TRIM32-/-的小鼠MGE區(qū)BrdU陽性的增殖的中間神經(jīng)前體細胞數(shù)明顯的少于其同窩對照的野生型小鼠(p=0.009)。同時,pH3陽性的細胞數(shù)較野生型小鼠也同樣是減少的(p=0.036)。而Caspase-3陽性的凋亡細胞數(shù),在TRIM32-/-和野生型小鼠的MGE區(qū)是沒有差異的(p=0.493)。免疫印跡的結果則顯示,TRIM32缺失之后MGE區(qū)的c-Myc和PI3K-Akt-mTOR信號分子表達水平明顯降低(c-Myc:p0.001;p-PI3K:p=0.022; p-Akt:p=0.01;p-mTOR:p0.001),而在TRIM32缺失之后的MGE區(qū)LC3Ⅱ型的表達量明顯升高(p=0.014)。結論：TRIM32的缺失導致胚胎時期MGE區(qū)增殖的中間神經(jīng)前體細胞數(shù)量減少,并最終可能導致成年大腦皮層抑制性中間神經(jīng)元的減少。此外,這種增殖的中間神經(jīng)前體細胞的減少與細胞凋亡并不相關,很有可能是受到c-Myc和威PI3K-Akt-mTOR信號通路的抑制所導致的。而這種抑制與TRIM32缺失之后蛋白的自噬溶酶體途徑被激活引起蛋白自噬降解有關。第五章氯硝西泮能夠部分改善TRIM32基因敲除小鼠的自閉癥樣行為障礙目的：探索氯硝西泮增強GABAergic神經(jīng)元抑制作用后能否改善TRIM32-/-小鼠的自閉癥樣行為障礙。方法：4-6月齡大的TRIM32-/-成年小鼠和其同窩對照的野生型小鼠,給予氯硝西泮(Clonazepam, CLZ) 0.025mg/kg的劑量于行為學測試前30min進行腹腔注射。對照組給予等量的0.9%生理鹽水(Saline, SAL)注射。測試小鼠具體分組為：TRIM32-/-小鼠氯硝西泮注射組(TRIM32-/-CLZ); TRIM32-/-生理鹽水注射組(TRIM32-/-SAL);野生型小鼠氯硝西泮注射組(TRIM32+/+CLZ);野生型小鼠生理鹽水注射組(TRIM32+/+SAL)。四組小鼠均進行自閉癥相關行為學的測試。包括社交行為(三室社交偏好實驗(3-Chamber social preference test)、筑巢實驗(Nest building)和刻板樣舉止(Y迷宮自發(fā)性選擇實驗(Y-maze spontaneous alternation)、自我捋毛實驗(Self-grooming))相關的實驗。結果：三室社交偏好實驗中,TRIM32-/-的小鼠經(jīng)CLZ注射后,在停留時間(Time in chamber)上明顯的更偏向于有陌生老鼠一側,而不是空籠子側(p=0.001)：而在交流時間(Interaction time)上,TRIM32-/- CLZ組雖然和TRIM32-/-SAL組一樣都是偏向于和陌生老鼠交流(p0.001),但是其和陌生老鼠交流的時間卻明顯的多于TRIM32-/- SAL組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.001)。當放入另一只陌生老鼠之后,TRIM32-/- CLZ組小鼠在停留時間上和TRIM32+/+ SAL組一樣,明顯的偏向于熟悉老鼠一側(p0.001),而不是和TRIM32-/- SAL組小鼠一樣對于熟悉和陌生小鼠沒有明顯的偏好差異(p=0.100),并且在交流時間上,TRIM32-/- CLZ組小鼠更多的和陌生老鼠交流(p0.001),而不是像TRIM32-/ SAL組小鼠一樣對于陌生和熟悉小鼠沒有交流時間上的差異(p=0.396)。但是在反應Home-social行為的筑巢實驗中,我們并沒有觀察到氯硝西泮能夠顯著提高TRIM32-/-小鼠的筑巢評分(p=0.374)。此外,在反映刻板樣行為的Y迷宮自發(fā)性選擇實驗中,TRIM32-/- CLZ組小鼠較TRIM32-/- SAL組而言明顯的減少了未改變的目標臂選擇比例(p=0.042)。結論：TRIM32-/-的小鼠經(jīng)CLZ注射后,能夠一定程度的改善其社交和刻板樣行為障礙,但對于重復行為的改善卻沒有明顯的作用。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.94

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本文編號：1314998