發(fā)布時(shí)間：2017-12-21 06:13

  本文關(guān)鍵詞：TRIM32的缺失導(dǎo)致小鼠自閉癥樣行為的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：自閉癥(Autism),又稱孤獨(dú)癥,是一種以嚴(yán)重的、廣泛的社會(huì)相互影響和溝通技能損害以及刻板的行為、興趣和活動(dòng)為特征的遺傳性、多樣性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病,目前也被廣稱為自閉癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder, ASD)�；颊叱１憩F(xiàn)出不同程度的社交能力,語(yǔ)言溝通能力以及相關(guān)日常生活能力的異常,同時(shí)還伴有心理發(fā)育滯緩,智力低下,癲癇等相關(guān)癥狀,更有患者出現(xiàn)睡眠異常、多動(dòng)以及注意力不集中等情況。這不僅對(duì)患者的健康、精神和生活造成極大的傷害,也給其家庭和社會(huì)帶來(lái)了許多的問(wèn)題和困難。目前,自閉癥已成為一種全球性的難題之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),全球大約有3500萬(wàn)人患有自閉癥,大約每150個(gè)人中就有1個(gè)自閉癥患者,而急速增長(zhǎng)的發(fā)病率,讓全世界對(duì)其越發(fā)的關(guān)注,為此聯(lián)合國(guó)將每年的4月2日命名為“世界自閉癥關(guān)注日”,以提醒全世界提高對(duì)自閉癥的關(guān)注和認(rèn)識(shí)。遺憾的是,目前對(duì)于自閉癥的發(fā)病原因仍不完全清楚。自閉癥患者的大腦皮層、海馬以及杏仁核存在著不同形式的發(fā)育異常,關(guān)鍵腦區(qū)神經(jīng)元異常增多,導(dǎo)致局部區(qū)域的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)過(guò)度連接；早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中,神經(jīng)元遷移異常,導(dǎo)致神經(jīng)元異常定位：不同區(qū)域興奮-抑制性神經(jīng)元失衡,導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)異常；神經(jīng)元突觸和樹(shù)突棘的異常發(fā)育導(dǎo)致神經(jīng)元之間信號(hào)傳導(dǎo)異常等都可能與自閉癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TRIM32 (Tripartite motif 32)是一種具有E3泛素鏈接酶活性的蛋白,其蛋白結(jié)構(gòu)中除了具有TRIM家族特征性的鋅指結(jié)構(gòu)域、B-boxes結(jié)構(gòu)域和卷曲結(jié)構(gòu)域之外,還有其獨(dú)特的6個(gè)重復(fù)性的NHL結(jié)構(gòu)域。先前的大量研究表明TRIM32在肌肉系統(tǒng)中有著重要的作用：TRIM32能夠調(diào)節(jié)骨骼肌干細(xì)胞的分化,TRIM32遺傳性的缺失常常導(dǎo)致2H型肢帶肌營(yíng)養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy type 2H (LGMD2H));在癌癥領(lǐng)域TRIM32被廣泛的報(bào)道參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外,TRIM32在巴爾德-別德?tīng)柧C合征(Bardet-Biedl syndrome(BBS))中也起著重要的作用。近年來(lái),隨著TRIM32被廣泛的關(guān)注和研究,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的作用也逐漸被認(rèn)識(shí)：TRIM32作為細(xì)胞命運(yùn)的決定子,不僅能夠調(diào)節(jié)胚胎神經(jīng)前體細(xì)胞往神經(jīng)元方向分化,也能夠參與成年神經(jīng)前體細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生;而TRIM32的遺傳性丟失可以導(dǎo)致嗅球區(qū)神經(jīng)元的過(guò)量產(chǎn)生并最終引起嗅覺(jué)能力的損害。與此同時(shí),許多與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病也被廣泛地和TRIM32聯(lián)系到了一起,這其中包括：阿爾茨海默病(Alzhermer's Disease, AD)、注意力缺陷多動(dòng)癥(Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD)、焦慮和強(qiáng)迫癥(Obsessive Compulsive Disorder, OCD)等,而自閉癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder, ASD)作為一種廣泛性的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性的疾病不可避免的也被聯(lián)系到了一起。本研究中我們首先揭示了TRIM32高表達(dá)于小鼠成熟的大腦皮層神經(jīng)元以及胎腦的MGE區(qū)中間神經(jīng)前體細(xì)胞中,然后通過(guò)在TRM32基因敲除小鼠中進(jìn)行自閉癥相關(guān)行為學(xué)的測(cè)試,發(fā)現(xiàn)TRIM32的遺傳性缺失導(dǎo)致小鼠表現(xiàn)出了自閉癥核心的社交障礙和重復(fù)刻板樣舉止。同時(shí),γ-氨基丁酸能(GABAergic)抑制性神經(jīng)元的大量減少在TRIM32敲除的小鼠大腦皮層中被發(fā)現(xiàn)；進(jìn)一步研究表明這種減少的GABAergic抑制性神經(jīng)元是由于胚胎發(fā)育過(guò)程中TRIM32的缺失導(dǎo)致中間神經(jīng)節(jié)隆起(Medial ganglionic eminence,MGE)區(qū)的中間神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分裂減少所致,而這種增殖分裂減少的內(nèi)在機(jī)制是由于TRIM32的缺失導(dǎo)致c-Myc和PI3K-Akt-mTOR等信號(hào)分子發(fā)生溶酶體自噬降解所致。此外,本研究還通過(guò)增強(qiáng)GABAergic神經(jīng)元突觸抑制作用的藥物氯硝西泮(Clonazepam)成功地改善了TRIM32敲除小鼠的社交行為和刻板樣行為障礙。第一章TRIM32基因在成年小鼠大腦皮層和胚胎小鼠MGE區(qū)表達(dá)情況的研究目的：研究成年小鼠大腦皮層和胚胎小鼠MGE區(qū)TRIM32的表達(dá)情況。方法：分別取材3個(gè)月齡和孕13.5天(E13.5)的野生小鼠的端腦,后放入4%的多聚甲醛中后固定,經(jīng)30%的蔗糖脫水后進(jìn)行冰凍切片。取相應(yīng)組織的切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)熒光染色以揭示TRIM32在兩種組織中的表達(dá)和分布情況。結(jié)果：在3月齡的小鼠大腦皮層中,TRIM32主要表達(dá)于NeuN陽(yáng)性的成熟神經(jīng)元中而在GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和Ibal陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞中卻沒(méi)有表達(dá)；而在孕13.5天(E13.5)的胎腦中,TRIM32在MGE區(qū)高表達(dá)于Sox2陽(yáng)性的中間神經(jīng)前體細(xì)胞中。結(jié)論：TRIM32在成年大腦皮層中特定表達(dá)于成熟的神經(jīng)元中但不表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中,而在胚胎時(shí)期的MGE區(qū)高表達(dá)于中間神經(jīng)前體細(xì)胞中,這說(shuō)明TRIM32可能參與了MGE區(qū)中間神經(jīng)前體細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生方面的調(diào)控。第二章TRIM32遺傳性的缺失導(dǎo)致了小鼠自閉癥樣行為目的：明確TRIM32的缺失是否可以引起小鼠自閉癥樣行為。方法：采用TRIM32基因敲除(TRIM32-/-)小鼠和其同窩對(duì)照的野生(TRIM32+/+)小鼠進(jìn)行自閉癥相關(guān)的行為學(xué)測(cè)試,包括社交行為(三室社交偏好實(shí)驗(yàn)(3-Chamber social preference test)、雙向互動(dòng)實(shí)驗(yàn)(Reciprocal interaction)、少年玩耍實(shí)驗(yàn)(Juvenil play)、筑巢實(shí)驗(yàn)(Nest building)和刻板樣舉止(Y迷宮自發(fā)性選擇實(shí)驗(yàn)(Y-maze spontaneous alternation)、自我捋毛實(shí)驗(yàn)(Self-grooming))相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：TRIM32-/-小鼠表現(xiàn)出了自閉癥樣的行為障礙。具體表現(xiàn)為：在3-chambers實(shí)驗(yàn)中,TRIM32-/-小鼠對(duì)于在空籠子和陌生小鼠側(cè)的停留時(shí)間(time in chamber)上沒(méi)有明顯的差異(p=1.00),但是在與陌生小鼠的交流時(shí)間(interaction time)上,TRIM32-/-的小鼠明顯少于TRIM32+/+小鼠(p=0.016),雖然TRIM32-/-小鼠對(duì)于空籠子來(lái)說(shuō)更加的偏好于和陌生老鼠交流(p=0.004)；進(jìn)一步地,當(dāng)另一只陌生小鼠被放入空籠子中的時(shí),TRIM32-/-的小鼠對(duì)于兩側(cè)的小鼠無(wú)論在停留時(shí)間(p=0.396)還是交流時(shí)間(p=0.544)上都沒(méi)有明顯的差異。在Reciprocal interaction實(shí)驗(yàn)中,TRIM32-/-的小鼠雖然在互動(dòng)過(guò)程中展示出的攻擊性行為時(shí)間和野生小鼠沒(méi)有明顯的差異(p=0.113),但是表現(xiàn)出非攻擊性行為的時(shí)間卻明顯的低于野生對(duì)照的小鼠(p=0.013)。同樣地,我們用出生之后21天(P21)的TRIM32-/-小鼠和同窩對(duì)照的TRIM32+/+小鼠進(jìn)行了Juvenil play實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示TRIM32-/-的小鼠相對(duì)于野生小鼠而言表現(xiàn)出更少的社交行為(Social) (p=0.024)而重復(fù)性的捋毛行為(Grooming)卻明顯地多于野生小鼠(p=0.033),但是在逃避性的挖掘動(dòng)作(Digging)方面卻沒(méi)有明顯的區(qū)別(p=0.883)。在反映home social行為的筑巢實(shí)驗(yàn)(Nest building)中,我們同樣發(fā)現(xiàn)了TRIM32-/-的小鼠有更差的表現(xiàn)(p=0.003)。此外,刻板樣舉止的檢測(cè)中,Y迷宮自發(fā)性選擇實(shí)驗(yàn)和自我捋毛實(shí)驗(yàn)均顯示TRIM32-/-的小鼠有更多的偏執(zhí)行為和重復(fù)動(dòng)作(Y-maze spontaneous alternation test:p=0.008; Self-grooming:p =0.033)。結(jié)論：TRIM32基因敲除小鼠展示出了自閉癥樣的行為障礙。第三章TRIM32的缺失導(dǎo)致大腦皮層GABAergic的抑制性中間神經(jīng)元數(shù)量減少目的：探索TRIM32缺失之后小鼠大腦皮層GABAergic的抑制性中間神經(jīng)元數(shù)量的變化。方法：取出生后21天大小的TRIM32-/-小鼠和其同窩對(duì)照的野生型小鼠大腦,經(jīng)4%的多聚甲醛灌注后再后固定24小時(shí),而后經(jīng)30%的蔗糖脫水處理之后進(jìn)行冰凍切片。切片中進(jìn)行小清蛋白(Parvalbumin(PV)),鈣網(wǎng)膜蛋白(Calretinin(CR)),神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y(NPY)),生長(zhǎng)抑素(Somatostain(SST))等中間神經(jīng)元抗體的免疫熒光染色,并統(tǒng)計(jì)其在TRIM32-/-和野生小鼠大腦皮層中的數(shù)量差異。結(jié)果：在出生后21天的青年TRIM32-/-小鼠大腦皮層中,PV、CR、 NPY、 SST等蛋白陽(yáng)性的中間神經(jīng)元數(shù)量較其同窩對(duì)照的野生型小鼠均是明顯降低的。(PV:p0.001; CR:p0.001;NPY:p0.001; SST:p=0.005).結(jié)論：TRIM32的缺失導(dǎo)致小鼠大腦皮層多種中間神經(jīng)元數(shù)量減少。第四章胚胎MGE區(qū)中間神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的減少導(dǎo)致大腦皮層中間神經(jīng)元數(shù)量減少目的：探索RIM32缺失之后導(dǎo)致大腦皮層中間神經(jīng)元數(shù)量減少的原因和機(jī)制。方法：孕13.5天(E13.5)的TRIM32雜合(TRIM32+/-)小鼠,于處死前30min給予BrdU (50mg/kg)腹腔注射,后取胚胎TRIM32-/-小鼠及其同窩對(duì)照的野生小鼠端腦,經(jīng)固定,脫水處理后進(jìn)行冰凍切片。在切片中進(jìn)行BrdU免疫組織熒光染色,并統(tǒng)計(jì)MGE區(qū)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量差異。此外,我們還進(jìn)行pH3抗體的熒光染色,并統(tǒng)計(jì)其在兩組小鼠MGE區(qū)的數(shù)量差異。而Caspase-3抗體的染色被同樣的進(jìn)行,并計(jì)數(shù)。進(jìn)一步地,我們通過(guò)Western-Blotting免疫印跡的方法,還對(duì)MGE區(qū)c-Myc和PI3K-Akt-mTOR等與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的分子和信號(hào)通路,以及與自噬溶酶體蛋白降解途徑激活相關(guān)的分子——微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)等進(jìn)行了表達(dá)量的檢測(cè)。.結(jié)果：免疫熒光染色BrdU后計(jì)數(shù)顯示,TRIM32-/-的小鼠MGE區(qū)BrdU陽(yáng)性的增殖的中間神經(jīng)前體細(xì)胞數(shù)明顯的少于其同窩對(duì)照的野生型小鼠(p=0.009)。同時(shí),pH3陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)較野生型小鼠也同樣是減少的(p=0.036)。而Caspase-3陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞數(shù),在TRIM32-/-和野生型小鼠的MGE區(qū)是沒(méi)有差異的(p=0.493)。免疫印跡的結(jié)果則顯示,TRIM32缺失之后MGE區(qū)的c-Myc和PI3K-Akt-mTOR信號(hào)分子表達(dá)水平明顯降低(c-Myc:p0.001;p-PI3K:p=0.022; p-Akt:p=0.01;p-mTOR:p0.001),而在TRIM32缺失之后的MGE區(qū)LC3Ⅱ型的表達(dá)量明顯升高(p=0.014)。結(jié)論：TRIM32的缺失導(dǎo)致胚胎時(shí)期MGE區(qū)增殖的中間神經(jīng)前體細(xì)胞數(shù)量減少,并最終可能導(dǎo)致成年大腦皮層抑制性中間神經(jīng)元的減少。此外,這種增殖的中間神經(jīng)前體細(xì)胞的減少與細(xì)胞凋亡并不相關(guān),很有可能是受到c-Myc和威PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的抑制所導(dǎo)致的。而這種抑制與TRIM32缺失之后蛋白的自噬溶酶體途徑被激活引起蛋白自噬降解有關(guān)。第五章氯硝西泮能夠部分改善TRIM32基因敲除小鼠的自閉癥樣行為障礙目的：探索氯硝西泮增強(qiáng)GABAergic神經(jīng)元抑制作用后能否改善TRIM32-/-小鼠的自閉癥樣行為障礙。方法：4-6月齡大的TRIM32-/-成年小鼠和其同窩對(duì)照的野生型小鼠,給予氯硝西泮(Clonazepam, CLZ) 0.025mg/kg的劑量于行為學(xué)測(cè)試前30min進(jìn)行腹腔注射。對(duì)照組給予等量的0.9%生理鹽水(Saline, SAL)注射。測(cè)試小鼠具體分組為：TRIM32-/-小鼠氯硝西泮注射組(TRIM32-/-CLZ); TRIM32-/-生理鹽水注射組(TRIM32-/-SAL);野生型小鼠氯硝西泮注射組(TRIM32+/+CLZ);野生型小鼠生理鹽水注射組(TRIM32+/+SAL)。四組小鼠均進(jìn)行自閉癥相關(guān)行為學(xué)的測(cè)試。包括社交行為(三室社交偏好實(shí)驗(yàn)(3-Chamber social preference test)、筑巢實(shí)驗(yàn)(Nest building)和刻板樣舉止(Y迷宮自發(fā)性選擇實(shí)驗(yàn)(Y-maze spontaneous alternation)、自我捋毛實(shí)驗(yàn)(Self-grooming))相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：三室社交偏好實(shí)驗(yàn)中,TRIM32-/-的小鼠經(jīng)CLZ注射后,在停留時(shí)間(Time in chamber)上明顯的更偏向于有陌生老鼠一側(cè),而不是空籠子側(cè)(p=0.001)：而在交流時(shí)間(Interaction time)上,TRIM32-/- CLZ組雖然和TRIM32-/-SAL組一樣都是偏向于和陌生老鼠交流(p0.001),但是其和陌生老鼠交流的時(shí)間卻明顯的多于TRIM32-/- SAL組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。當(dāng)放入另一只陌生老鼠之后,TRIM32-/- CLZ組小鼠在停留時(shí)間上和TRIM32+/+ SAL組一樣,明顯的偏向于熟悉老鼠一側(cè)(p0.001),而不是和TRIM32-/- SAL組小鼠一樣對(duì)于熟悉和陌生小鼠沒(méi)有明顯的偏好差異(p=0.100),并且在交流時(shí)間上,TRIM32-/- CLZ組小鼠更多的和陌生老鼠交流(p0.001),而不是像TRIM32-/ SAL組小鼠一樣對(duì)于陌生和熟悉小鼠沒(méi)有交流時(shí)間上的差異(p=0.396)。但是在反應(yīng)Home-social行為的筑巢實(shí)驗(yàn)中,我們并沒(méi)有觀察到氯硝西泮能夠顯著提高TRIM32-/-小鼠的筑巢評(píng)分(p=0.374)。此外,在反映刻板樣行為的Y迷宮自發(fā)性選擇實(shí)驗(yàn)中,TRIM32-/- CLZ組小鼠較TRIM32-/- SAL組而言明顯的減少了未改變的目標(biāo)臂選擇比例(p=0.042)。結(jié)論：TRIM32-/-的小鼠經(jīng)CLZ注射后,能夠一定程度的改善其社交和刻板樣行為障礙,但對(duì)于重復(fù)行為的改善卻沒(méi)有明顯的作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.94

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本文編號(hào)：1314998