本文關(guān)鍵詞：人類EBLN1基因生物學(xué)功能、作用機制及其與抑郁癥的關(guān)系初探　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景： 近年研究發(fā)現(xiàn)許多病毒能成為其宿主遺傳物質(zhì)的一部分，由病毒DNA（或病毒RNA的DNA拷貝）整合于宿主生殖細(xì)胞而產(chǎn)生，這種現(xiàn)象被稱為“內(nèi)生化（endogenization）”，其整合序列稱為內(nèi)源性病毒序列（endogenous viral elements，EVEs)。最初人們以為只有逆轉(zhuǎn)錄病毒存在整合入基因組而內(nèi)生化的現(xiàn)象，后來的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在真核生物基因組中除逆轉(zhuǎn)錄病毒外還存在DNA病毒、甚至RNA病毒留下的整合序列，分別稱之為內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous Retrovirus，ERV）、內(nèi)源性DNA病毒、非逆轉(zhuǎn)錄整合RNA病毒（Non-retroviralIntegrated RNA Virus，NIRV）。這些EVEs的形成、進(jìn)化過程、潛在功能引起了科學(xué)家們的極大興趣。 2010年1月，Horie等在Nature刊文報道在包括人類在內(nèi)的多種哺乳動物基因組中發(fā)現(xiàn)存在與博爾納病病毒（Borna disease virus,BDV）N基因具有同源性的片段，稱之為內(nèi)源性博爾納樣核蛋白序列（EBLN)。這是首個報道的存在于哺乳動物包括人類基因組中的NIRV。存在于人類基因組中的EBLN有四個，分別命名為EBLN1、EBLN2、 EBLN3、 EBLN4，其中EBLN1與BDV N氨基酸序列相似性最高，為58%。通過基因序列分析發(fā)現(xiàn)EBLN1存在一個長開放讀碼框（ORF），可編碼366個氨基酸，與含370個氨基酸的BDV N蛋白長度相當(dāng)接近，且這些ORF在其他簡鼻亞目靈長類物種中亦呈相對保守。人類表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)庫中可檢測到EBLN1。此外，EBLN1基因已被證實在OL、293T、MOLT4等人類細(xì)胞系中存在轉(zhuǎn)錄。這些線索均提示EBLN1基因可以編碼蛋白質(zhì)，很可能為有功能的結(jié)構(gòu)基因。然而，EBLN1作為一個新發(fā)現(xiàn)的NIRV基因，，目前人們對其基本結(jié)構(gòu)表達(dá)特征仍知之甚少，缺乏系統(tǒng)全面的了解，且其發(fā)揮的具體生物學(xué)功能，是否與疾病發(fā)生有關(guān)目前仍不清楚。 BDV是一種代表性且研究最多的與精神疾病有關(guān)的病毒，屬于非分節(jié)段單股負(fù)鏈有包膜RNA病毒，具有高度的嗜神經(jīng)性，為單分子負(fù)鏈RNA病毒目博爾納病毒科博爾納病毒屬的唯一成員，其一個顯著特征為核內(nèi)復(fù)制轉(zhuǎn)錄。近年來國內(nèi)外的大量流行病學(xué)調(diào)查、病例對照研究、病毒分離及臨床實驗研究結(jié)果提示BDV與重性抑郁、雙相情感障礙等精神疾病發(fā)病密切相關(guān)，揭示BDV很可能為人類精神疾病的風(fēng)險因子。此外，BDV的一個獨特特征為主要侵犯邊緣系統(tǒng)尤其是海馬，感染動物可引起焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙、過度興奮等精神行為異常和發(fā)育障礙癥狀，類似于人類情感障礙、精神分裂癥及孤獨癥等疾病。正因為BDV感染與精神疾病包括抑郁癥的發(fā)生存在的密切關(guān)系，在2008年的國際博爾納病病毒研究會議上BDV作為“情感病毒”這一概念被提出。 與NIRV同屬EVE的人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒HERV，最早于1970年代初期即被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已有較多相關(guān)研究。人類基因組計劃發(fā)現(xiàn)HERV約占了整個基因組的8％，有較多報道提示HERV具有編碼基因的表達(dá)參與胚胎發(fā)育、免疫抑制、細(xì)胞分化等宿主細(xì)胞生理功能、對其他基因的順式調(diào)控作用以及發(fā)揮抗病毒免疫作用。另外還發(fā)現(xiàn)HERV與人類關(guān)系密切且其異常表達(dá)可能參與多種疾病。例如可能參與一些自身免疫性疾病、精神分裂癥、一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 總之，EBLN1與BDV P40蛋白氨基酸序列具有58%的相似度，呈高度同源性，可能具有相似的生物學(xué)功能及致病性。EBLN與HERV同屬內(nèi)源性病毒序列，皆是外源性病毒感染宿主后整合入宿主基因組內(nèi)的病毒“化石”，有理由推測兩者具有類似的生物學(xué)特性，EBLN可能也與HERV一樣其表達(dá)異常與疾病發(fā)生有關(guān)。此外，文獻(xiàn)報道已證實EBLN1可在OL神經(jīng)細(xì)胞株中呈較高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)�；谝陨暇�索，我們推測EBLN1可能具有一些重要的生物學(xué)功能，并參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展，成為聯(lián)系BDV感染與抑郁癥的一個重要橋梁。 目的： 初步探討EBLN1基因的基本功能、作用機制及其在抑郁癥中可能發(fā)揮的作用，并試圖探討EBLN1基因SNP多態(tài)性與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性，從而明確EBLN1是否為抑郁癥的一種新易感基因，以為BDV與抑郁癥關(guān)系提供分子遺傳學(xué)證據(jù)，為后續(xù)深入認(rèn)識這一新的NIRV基因奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步闡明BDV感染與人類精神疾病尤其是抑郁癥的內(nèi)在聯(lián)系提供線索。 方法： 1、本研究首先采用RT-PCR檢測EBLN1基因在SY5Y、U87、OL、293T、PBMC五種人各種類型細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。然后從OL細(xì)胞中提取總RNA，分別利用5’-RACE和3′-RACE技術(shù)克隆人EBLN1基因全長cDNA序列，并對其開放讀碼框和非翻譯區(qū)結(jié)構(gòu)以及編碼氨基酸進(jìn)行初步分析預(yù)測。 2、構(gòu)建EBLN1RNA干擾慢病毒載體并進(jìn)行病毒包裝，用兩種BDV病毒株分別平行感染EBLN1RNA干擾組及對照組OL細(xì)胞后，應(yīng)用基于Taqman探針法RT-qPCR、WB、FFU三種方法分別檢測BDVP24/P40基因、蛋白含量及病毒滴度，以評價EBLN1對OL細(xì)胞感染兩種BDV病毒株的易感性的影響。然后采用基于慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)通過MTT、Transwell、劃痕實驗觀察EBLN1基因在細(xì)胞增殖、遷移、運動這些基本生物學(xué)功能中的作用。并通過基因芯片方法系統(tǒng)篩查EBLN1可能影響的下游基因。 3、收集抑郁癥患者及健康對照PBMC樣本各94例，提取總RNA，采用基于2-△△Ct相對定量分析的SYBR Green法RT-qPCR檢測EBLN1基因的轉(zhuǎn)錄水平，用GAPDH作為內(nèi)參矯正。比較組間是否存在統(tǒng)計學(xué)差異，以明確EBLN1基因表達(dá)與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性。 4、納入抑郁癥患者389例，健康對照者301例，提取全血DNA，采用PCR直接測序方法篩選中國重慶地區(qū)人群中EBLN1基因SNP位點，并對篩選出的位點在抑郁癥與健康對照組中進(jìn)行SNP關(guān)聯(lián)分析。 結(jié)果： 1、采用RT-PCR方法檢測EBLN1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該五種類型細(xì)胞中均存在EBLN1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過RACE技術(shù)，得到了EBLN1基因的全長cDNA，且發(fā)現(xiàn)比Genbank數(shù)據(jù)庫中已知序列更長，存在5’UTR部分序列。 2、EBLN1RNA干擾組中在大部分時間點兩種病毒株P(guān)24/P40基因、蛋白含量及病毒滴度分別均顯著高于相應(yīng)對照組（P0.05），三種方法檢測呈現(xiàn)較一致的趨勢。EBLN1RNA干擾慢病毒感染OL細(xì)胞后，與陰性對照病毒比較，MTT結(jié)果顯示從第2天開始至第5天，其細(xì)胞增殖數(shù)量顯著降低（P0.05），Transwell實驗顯示20小時后其細(xì)胞遷移率顯著降低（P0.05），劃痕實驗顯示形成劃痕6小時、20小時后遷移率均顯著下降，提示細(xì)胞愈傷能力受到影響（P0.05）。通過基因芯片分析EBLN1RNA干擾組及對照組OL細(xì)胞，篩選出1067條上調(diào)基因，2004條下調(diào)基因。Pathway分析提示RNA干擾EBLN1后引起多個信號通路改變，其中較顯著的有細(xì)胞周期、MAPK、P53、凋亡等相關(guān)通路。 3、抑郁癥組PBMC中EBLN1mRNA水平顯著低于對照組，約為對照組的1/4，且有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.001）。 4、PCR直接測序方法篩選中國重慶地區(qū)人群中EBLN1基因SNP位點結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)中國重慶地區(qū)人群中EBLN1基因存在SNP變異以及EBLN1SNP基因多態(tài)性與重性抑郁存在關(guān)聯(lián)性的證據(jù)， 結(jié)論： 1、證實EBLN1基因在人體各組織細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，尤其在三種類型神經(jīng)細(xì)胞中呈較高水平表達(dá)，提示EBLN1基因可能在神經(jīng)系統(tǒng)生理功能發(fā)揮重要作用，并通過RACE技術(shù)得到了cDNA全長序列，這些結(jié)果為后續(xù)開展EBLN1的生理功能及與疾病相關(guān)性研究提供了線索與依據(jù)。 2、發(fā)現(xiàn)了EBLN1的抗BDV病毒免疫及促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、愈傷能力的作用，并通過基因芯片方法系統(tǒng)篩查了EBLN1可能影響的下游基因，并推測MAPK、P53及細(xì)胞周期通路或RND3基因的上調(diào)參與了EBLN1促進(jìn)OL細(xì)胞增殖遷移的作用，對理解認(rèn)識EBLN1的生物學(xué)功能及作用機制進(jìn)行了初探。 3、證實抑郁癥患者PBMC中EBLN1基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào)，預(yù)示EBLN1基因可能起抗抑郁作用。 4、未發(fā)現(xiàn)中國重慶地區(qū)人群中EBLN1基因存在SNP變異以及EBLN1SNP基因多態(tài)性與重性抑郁存在關(guān)聯(lián)性的證據(jù)，提示抑郁癥患者中EBLN1基因轉(zhuǎn)錄水平改變可能不是由其基因多態(tài)性引起。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1309088