本文關(guān)鍵詞：硫酸酯酶抑制劑DU-14拮抗淀粉樣β蛋白神經(jīng)毒性的行為學(xué)及電生理研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)即老年性癡呆癥,是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性、原發(fā)性、漸進(jìn)性、不可逆性的退行性變,常表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、精神行為異常和生活能力下降。AD的典型病理特征為腦內(nèi)出現(xiàn)以淀粉樣p蛋白(myloid β protein, Aβ)為核心的老年斑、磷酸化tau蛋白(Phosphorylated tau protein, P-tau)為主要成分的神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元的丟失。 目前,關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制存在眾多假說(shuō),諸如Aβ級(jí)聯(lián)假說(shuō)、tau蛋白假說(shuō)、氧化應(yīng)激假說(shuō)、神經(jīng)炎性假說(shuō)、鈣平衡自體失衡假說(shuō)、膽堿能假說(shuō)及興奮毒假說(shuō)等,其中Ap級(jí)聯(lián)假說(shuō)被廣泛認(rèn)可。Aβ作為老年斑的核心成分,已被證明具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性,其在AD患者腦內(nèi)(尤其是海馬內(nèi))沉積而引起細(xì)胞鈣超載、膽堿能系統(tǒng)損害、突觸數(shù)目減少及神經(jīng)元變性死亡是AD患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的主要病因。 神經(jīng)甾體(neurosteroid)是神經(jīng)系統(tǒng)中(主要是腦內(nèi))以膽固醇為底物,經(jīng)相關(guān)酶催化合成的甾體類物質(zhì)。神經(jīng)甾體主要包括脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone, DHEA)及其硫酸酯(Dehydroepiandrosterone sulfate, DHEAS)、孕烯醇酮及其硫酸酯、孕酮及別孕烯醇酮等。神經(jīng)甾體在腦、血漿及腎上腺中的水平往往隨年齡增高而減低,與此同時(shí)常伴發(fā)年齡相關(guān)的神經(jīng)功能障礙及神經(jīng)退行性變,諸如AD、帕金森病、C型尼曼—匹克病等。這提示神經(jīng)甾體作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子能夠使神經(jīng)元免受有毒物質(zhì)的損傷。近年研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)甾體尤其是DHEAS與AD等神經(jīng)退行性疾病存在密切相關(guān)性。AD患者下丘腦常出現(xiàn)DHEAS的減低伴P-tau的增多,紋狀體和小腦中出現(xiàn)DHEAS減低伴Ap的增多。DHEAS與這些構(gòu)成神經(jīng)原纖維纏結(jié)和老年斑的關(guān)鍵蛋白的相關(guān)性提示,腦內(nèi)DHEAS在AD的病理進(jìn)程中具有極其重要的作用,其水平的減低可能與AD發(fā)病有關(guān)。另外,研究還證明,DHEAS能夠拮抗NMDA介導(dǎo)的興奮毒性、促進(jìn)乙酰膽堿(ACh)的釋放并有效地抑制由Ap引起的鈣超載。 一般情況下,DHEA及DHEAS在腦內(nèi)含量隨年齡增高而逐漸減低,但AD患者腦內(nèi)特別是海馬及顳葉皮層中DHEA水平顯著增高,而同時(shí)DHEAS水平則出現(xiàn)下降。據(jù)此推測(cè),AD患者腦內(nèi)的DHEA與DHEAS的轉(zhuǎn)化存在異常。鑒于DHEAS可被甾體硫酸酯酶作用脫去硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為單體形式的DHEA,我們提出假設(shè)：通過(guò)使用硫酸酯酶抑制劑DU-14抑制硫酸酯酶的活性可以提高腦內(nèi)DHEAS水平,有可能拮抗Aβ引起的神經(jīng)毒性傷害,改善學(xué)習(xí)記憶功能、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)電活動(dòng)及突觸可塑性。 本研究通過(guò)雙側(cè)海馬注射Aβ1-42建立AD的動(dòng)物模型,借助Morris水迷宮試驗(yàn)、在體海馬局部場(chǎng)電位(local field potential, LFP)和在體海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation, LTP)記錄等實(shí)驗(yàn)手段,通過(guò)析因設(shè)計(jì)觀察DU-14是否能夠拮抗由Aβ1-42引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電活動(dòng)以及突觸可塑性的損害,旨在探討DHEAS的神經(jīng)保護(hù)作用并為AD預(yù)防治療藥物的研發(fā)提供新的思路。 研究主要包括以下內(nèi)容：(1)利用Morris水迷宮試驗(yàn)觀察海馬注射Ap1-42是否可以導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的損傷,DU-14是否能夠有效拮抗由Aβ1-42導(dǎo)致的這一損傷；(2)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,觀察同一批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動(dòng),探討DU-14是否能夠拮抗Aβ1-42造成Theta節(jié)律異常；(3)利用在體海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)記錄技術(shù),觀察Aβ1-42對(duì)海馬突觸可塑性的影響,并探討DU-14是否能夠拮抗Aβ1-42引起的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的壓抑。 第一部分DU-14拮抗Ap1-42導(dǎo)致的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷 目的：探討Aβ1-42引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷能否被DU-14預(yù)處理所拮抗。 方法：選取運(yùn)動(dòng)功能正常、無(wú)視力障礙的健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(180g～220g),隨機(jī)分成四組:vehicle+saline組,DU-14+saline組,vehicle+Aβ組及DU-14+Aβ組。將大鼠麻醉后,在三維腦立體定位儀引導(dǎo)下,將藥物用微量注射泵緩慢注射到雙側(cè)海馬CAl區(qū)。縫合手術(shù)創(chuàng)口,待其清醒并恢復(fù)兩周后,進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)。本試驗(yàn)由三部分組成：定位航行試驗(yàn),用以評(píng)估空間學(xué)習(xí)能力；空間探索試驗(yàn),用以評(píng)估空間記憶能力；可視平臺(tái)試驗(yàn),用以排除大鼠的運(yùn)動(dòng)和視力障礙。主要觀察指標(biāo)為各組大鼠的逃避潛伏期、在目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比及平均游泳速度。 結(jié)果：(1)定位航行試驗(yàn)顯示,在第1～5天中隨著訓(xùn)練天數(shù)的推移,各組大鼠找到水下平臺(tái)的潛伏期明顯縮短,反映了大鼠的空間學(xué)習(xí)過(guò)程。在第2～5訓(xùn)練日的同一天內(nèi),vehicle+Aβ組大鼠找到水下平臺(tái)的潛伏期明顯長(zhǎng)于vehicle+saline組(P0.001);而DU-14+Aβ組大鼠的逃避潛伏期明顯低于vehicle+Aβ組(P0.001)。(2)空間探索試驗(yàn)顯示,在撤除水下平臺(tái)后,vehicle+Aβ組大鼠在目標(biāo)象限(原平臺(tái)所在象限)的游泳時(shí)間百分比明顯小于vehicle+saline組(P0.001)；而DU-14+Aβ組大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間的百分比明顯較vehicle+Aβ組高(P0.001)。(3)可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)顯示,各處理組間大鼠平均游泳速度及到達(dá)可視平臺(tái)的潛伏期均沒(méi)有明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：雙側(cè)海馬注射Aβl-42可嚴(yán)重?fù)p傷大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力,而DU-14預(yù)處理可以有效拮抗Aβ1-42所致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害。該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示,神經(jīng)甾體硫酸酯酶抑制劑DU-14具有神經(jīng)保護(hù)作用,可能在改善AD患者認(rèn)知功能中發(fā)揮有益作用。 第二部分DU-14拮抗Aβ1-42對(duì)大鼠海馬theta節(jié)律的抑制 目的：觀察Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動(dòng)的影響,探討DU-14預(yù)處理是否可拮抗Aβ1-42對(duì)大鼠海馬CAl區(qū)theta節(jié)律的抑制作用。 方法：Morris水迷宮試驗(yàn)后的次日,經(jīng)烏拉坦適度麻醉后,分別對(duì)四組大鼠進(jìn)行在體海馬局部場(chǎng)電位theta節(jié)律的誘導(dǎo)和記錄。 結(jié)果：(1)雙側(cè)海馬注射DU-14及Aβ1-42對(duì)海馬CAl區(qū)theta節(jié)律功率峰對(duì)應(yīng)的頻率值無(wú)明顯影響。夾尾刺激后,vehicle+saline組,vehicle+Aβ組,DU-14+saline組及DU-14+Aβ組四組大鼠誘導(dǎo)出theta節(jié)律功率峰對(duì)應(yīng)的頻率值分別是3.26±0.05Hz,3.19±0.04Hz,3.21±0.07Hz,3.10±0.05Hz,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)雙側(cè)海馬注射Aβ1-42可明顯壓抑海馬CAl區(qū)theta節(jié)律功率峰值,單獨(dú)注射DU-14對(duì)海馬CAl區(qū)theta節(jié)律功率峰值無(wú)影響,但DU-14可有效拮抗Aβ1-42對(duì)大鼠海馬CAl區(qū)theta節(jié)律功率的抑制作用。對(duì)夾尾后誘導(dǎo)的theta節(jié)律進(jìn)行功率譜分析,發(fā)現(xiàn)vehicle+Aβ組大鼠海馬CAl區(qū)theta節(jié)律的功率峰值為22.29±0.78dB,明顯低于vehicle+saline組的28.78±1.10dB(P0.001)；而DU-14+Aβ組功率峰值為25.61±0.90dB,明顯高于vehicle+Aβ組(P0.01)。 結(jié)論：雙側(cè)海馬注射DU-14和Aβ1-42對(duì)由夾尾誘導(dǎo)的theta節(jié)律功率峰對(duì)應(yīng)的頻率值沒(méi)有明顯的影響, Aβ1-42可顯著壓抑海馬theta節(jié)律的功率峰值,而DU-14能夠有效拮抗Aβ1-42對(duì)海馬theta節(jié)律功率的抑制作用。初步提示,DU-14可通過(guò)拮抗Aβ1-42的神經(jīng)毒性,緩解Aβ1-42對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動(dòng)的損害。 第三部分DU-14拮抗Aβ1-42引起的大鼠海馬LTP壓抑 目的：觀察DU-14及Aβ1-42對(duì)大鼠海馬CAl區(qū)突觸可塑性長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響,從突觸可塑性角度探討DU-14拮抗Aβ1-42神經(jīng)毒性的電生理學(xué)機(jī)制。 方法：完成在體海馬局部場(chǎng)電位記錄之后,在腦立體定位儀的精確引導(dǎo)下,將自制的平行綁定電極(同心圓雙極刺激電極與單極記錄電極進(jìn)行綁定)插入到背側(cè)海馬,通過(guò)刺激海馬schaffer側(cè)支,在CAl區(qū)放射層記錄場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。選擇I/O曲線上50～65%最大fEPSP對(duì)應(yīng)的刺激強(qiáng)度的單個(gè)脈沖刺激來(lái)誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)fEPSP；至少穩(wěn)定記錄基礎(chǔ)fEPSP30分鐘后,通過(guò)雙脈沖刺激誘發(fā)、記錄雙脈沖易化(paired pulse facilitation,PPF);最后通過(guò)三組高頻刺激(high frequency stimulation,HFS)誘導(dǎo)LTP,刺激強(qiáng)度為I/O曲線上75～85%最大fEPSP對(duì)應(yīng)的刺激強(qiáng)度；在HFS刺激后恢復(fù)單脈沖刺激,刺激強(qiáng)度同誘發(fā)基礎(chǔ)fEPSP的刺激強(qiáng)度,至少記錄60分鐘。 結(jié)果：(1)雙側(cè)海馬注射DU-14及Ap1-42對(duì)海馬CAl區(qū)PPF無(wú)明顯影響,在給予雙脈沖刺激之后,vehicle+saline組、vehicle+Aβ組、DU-14+saline組及DU-14+Aβ組四組大鼠的fEPSP2/fEPSPl的值分別為165.5±5.9%、160.6±5.5%、158.3±5.8%、169.7±6.9%,各組之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)海馬注射Aβ1-42顯著抑制了HFS誘導(dǎo)的在體海馬CAl區(qū)的LTP,高頻刺激后即刻,vehicle+Aβ組LTP誘導(dǎo)值為135.2±2.9%,明顯低于vehicle+saline組的187.3±7.1%(P0.001)；同時(shí)海馬注射Aβ1-42也顯著抑制了LTP的維持,高頻刺激60分鐘后,vehicle+Aβ組LTP維持在128.2±3.1%,明顯低于vehicle+saline組的146.0±3.9%(P0.01)。(3)海馬單獨(dú)注射DU-14對(duì)LTP沒(méi)有明顯影響,但DU-14可以顯著拮抗Ap1-42對(duì)LTP的壓抑作用。高頻刺激后即刻,DU-14+Aβ組的LTP值為173.4±4.8%,明顯高于vehicle+Aβ組的135.2±2.9%(P0.001)；在高頻刺激后60分鐘時(shí),DU-14+Aβ組的LTP維持在143.9±4.2%,明顯高于vehicle+Aβ組的128.2±3.1%(P0.01)。 結(jié)論：海馬注射Aβ1-42可以明顯壓抑在體海馬CAl區(qū)LTP的誘導(dǎo)和維持,而對(duì)PPF無(wú)影響,說(shuō)明其對(duì)LTP的壓抑主要是通過(guò)突觸后機(jī)制而非影響突觸前的遞質(zhì)釋放。DU-14處理可以有效拮抗Aβ1-42對(duì)LTP的壓抑效應(yīng),提示在突觸層面上,DU-14具有神經(jīng)保護(hù)作用,可以使得突觸聯(lián)系和可塑性免受Aβ1-42的損傷。該部分研究結(jié)果與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動(dòng)及行為學(xué)的結(jié)果保持一致,可以從細(xì)胞、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、整體三個(gè)不同層面充分證實(shí)DU-14的神經(jīng)保護(hù)作用。 總之,本研究在同一批動(dòng)物模型上,使用Morris水迷宮試驗(yàn)及在體場(chǎng)電位記錄等多種技術(shù)手段,從不同層面證實(shí)了DU-14對(duì)Aβ1-42神經(jīng)毒性具有拮抗作用,并初步探討了這一作用可能涉及到的電生理機(jī)制。本研究為DU-14等神經(jīng)硫酸酯酶抑制劑用于AD的預(yù)防或治療提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉曉杰;楊威;祁金順;;氧化應(yīng)激與阿爾茨海默病[J];生理學(xué)報(bào);2012年01期

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本文編號(hào)：1295164