本文關(guān)鍵詞：遠(yuǎn)志提取物清除β淀粉樣蛋白的途徑及其信號(hào)通路的研究

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【摘要】：背景：目前在對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的發(fā)病機(jī)制研究中，β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）假說占據(jù)了重要地位。Aβ作為AD發(fā)病的起始因子，可導(dǎo)致淀粉樣斑塊（senile plaques,SP）的形成、Tau蛋白高度磷酸化、神經(jīng)纖維的纏結(jié)(neuron fiber tangles，NFT)、神經(jīng)元炎癥、神經(jīng)元功能喪失及死亡、癡呆等一系列病理變化。許多研發(fā)中的抗AD藥物都是將Aβ作為靶點(diǎn)，以減少其生成或促進(jìn)清除來延緩病程的發(fā)展。細(xì)胞自噬作為機(jī)體清除自身異常物質(zhì)的主要途徑，引起了研究者的廣泛關(guān)注，增加自噬作用可以促進(jìn)細(xì)胞清除過多的Aβ，這或許成為治療AD的一個(gè)重要策略。 目的：本研究從體外水平考察遠(yuǎn)志提取物（Polygala Tenuifolia Extract，PTE）對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)APP/BACE1的中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株分泌Aβ的影響，并進(jìn)一步探討細(xì)胞自噬在引起這一變化中的作用及信號(hào)通路改變。 方法：將復(fù)蘇的細(xì)胞培養(yǎng)于100mm培養(yǎng)皿內(nèi)，次日換液，待生長密度達(dá)80%-90%時(shí)傳代。從第三代開始，在細(xì)胞在生長對(duì)數(shù)期時(shí)種板，貼壁后用不同濃度（0、5、10、20、40、100μg/ml）的PTE處理24h，0μg/ml作為對(duì)照組，并進(jìn)行以下檢測研究： （1）MTT法檢測PTE對(duì)神經(jīng)細(xì)胞株活力的影響。另外，在外源性Aβ的毒性作用下，考察PTE對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用； （2）ELISA檢測CHO-APP/BACE1細(xì)胞分泌Aβ水平的變化； （3）熒光顯微鏡觀察MDC染色后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自噬小泡的變化；（4）Western blot考察自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)情況；（5）Western blot檢測與自噬通路密切相關(guān)的激酶mTOR、p70s6k、Akt、AMPK、Raptor及其磷酸化蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：（1）MTT結(jié)果顯示各濃度PTE處理組與對(duì)照組間細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）； （2）Aβ處理組細(xì)胞活力比未處理組明顯下降，表明Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有顯著的毒性，當(dāng)有PTE存在的情況下，且濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞活力有一定程度的恢復(fù)； （3）在10μg/ml PTE處理組時(shí)，CHO-APP/BACE1細(xì)胞分泌Aβ水平已經(jīng)有顯著下降（P0.01），并呈濃度依賴性； （4）熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，PTE處理后的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有更多的綠色圓點(diǎn)結(jié)構(gòu)，即被染色的自噬小泡； （5）Western blot結(jié)果表明，隨著給藥濃度增加，LC3蛋白逐漸由I型向II型轉(zhuǎn)變，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3II/LC3I逐漸增加； （6）Western blot結(jié)果顯示，自噬的抑制性激酶mTOR磷酸化水平隨著PTE濃度升高逐漸下降，其下游的p70s6k磷酸化水平也隨之降低。位于mTOR上游，能夠抑制mTOR活化的激酶AMPK和Raptor磷酸化水平升高，而另外一個(gè)通路中能夠促進(jìn)mTOR活化的Akt則沒有明顯變化。 結(jié)論：當(dāng)PTE在100μg/ml以下時(shí)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活力沒有影響，且有一定的細(xì)胞保護(hù)的作用；Western blot結(jié)果表明PTE可能是通過激活細(xì)胞AMPK/Raptor通路，抑制了mTOR和p70s6k的活化，誘導(dǎo)自噬作用增強(qiáng)，增強(qiáng)的自噬途徑促進(jìn)細(xì)胞清除過多的Aβ，，減少Aβ的分泌。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：1294288