本文關(guān)鍵詞：靶向調(diào)節(jié)NLRP1炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡治療阿爾茨海默病

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【摘要】：目的：研究NLRP1炎癥小體對(duì)β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β, Aβ)誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元焦亡的作用,及其在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)發(fā)生中的機(jī)制,探討靶向調(diào)節(jié)腦內(nèi)NLRP1炎癥小體對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠認(rèn)知功能和腦內(nèi)神經(jīng)病理的影響。方法：1、離體層面：分離純化大鼠皮層神經(jīng)元,應(yīng)用不同濃度的Aβ1-42作用于神經(jīng)元,測(cè)定神經(jīng)元活力和乳酸脫氫酶(LDH)釋放量,通過(guò)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),ASC熒光染色,了解神經(jīng)元的焦亡情況；同時(shí),采用免疫印跡法檢測(cè)Aβ1-42作用下NLRP1表達(dá)、Caspase-1活性水平,ELISA檢測(cè)IL-1β表達(dá)水平。應(yīng)用小干擾RNA (siRNA)技術(shù),了解NLRPl炎癥小體信號(hào)通路在Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡過(guò)程中的作用。2、活體層面：選取雄性3月、6月及9月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠以及其對(duì)照同源野生小鼠,通過(guò)免疫印跡法、熒光共定位法測(cè)定腦組織神經(jīng)元中NLRPl隨年齡變化的表達(dá)情況。之后選取5月齡APPswe/PS1dE9小鼠,隨機(jī)分為干擾組和對(duì)照組。干擾組于第三腦室通過(guò)微型滲透泵持續(xù)輸注NLRP1或Caspase-1 si RNA (0.11 μl/h)以抑制腦內(nèi)NLRP1或Caspase-1的表達(dá)；對(duì)照組輸注對(duì)照siRNA (0.11 μl/h)。6周后,干擾效率通過(guò)免疫印跡法以及RT-PCR法確認(rèn)。通過(guò)Morris水迷宮測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。通過(guò)免疫印跡法測(cè)定腦中Caspase-1活性水平、IL-1β表達(dá)水平的變化；通過(guò)TUNEL染色觀察小鼠皮層、海馬區(qū)神經(jīng)元TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比變化,尼氏染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞漿中的尼氏小體(Nissl body)變化,免疫組化觀察胞外淀粉樣斑的變化。結(jié)果：1、離體層面：5 μmol/L Aβ1-42與原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元共同孵育24h誘導(dǎo)神經(jīng)元焦亡,表現(xiàn)為T(mén)UNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多,LDH釋放量增加,ASC斑形成；同時(shí)NLRP1表達(dá)水平升高,Caspase-1激活,IL-1β釋放增多。用NLRP1 siRNA對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元進(jìn)行預(yù)處理48h后再加入Aβ1-42共同孵育,發(fā)現(xiàn)靶向抑制NLRP1對(duì)Aβ致神經(jīng)元焦亡損傷有明顯的保護(hù)作用,表現(xiàn)為T(mén)UNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,LDH釋放量減低；同時(shí)活化態(tài)Caspase-1明顯降低,IL-18釋放減少。2、活體層面：與同月齡對(duì)照小鼠相比,6月齡和9月齡APPswe/PS1dE9小鼠腦神經(jīng)元中NLRP1水平顯著升高。給予NLRP1或Caspase-1 siRNA 6周能降低APPswe/PS1dE9小鼠腦內(nèi)NLRP1或Caspase-1水平約50-60%。同時(shí),干擾組小鼠腦內(nèi)IL-1β水平明顯降低；神經(jīng)元胞漿中Nissl body改變減輕、數(shù)量增多,神經(jīng)元TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比減低,而胞外淀粉樣斑尚未見(jiàn)明顯變化。此外,Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中,干擾組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期及游行距離較對(duì)照組明顯縮短；空間探索實(shí)驗(yàn)中,干擾組小鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)。結(jié)論：NLRP1炎癥小體信號(hào)通路在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。靶向抑制腦內(nèi)NLRP1或Caspase-1表達(dá)可改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力以及腦內(nèi)神經(jīng)元焦亡。NLRP1炎癥小體有可能成為抗AD藥物作用的潛在新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：1264420