本文關鍵詞：1.妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素所致子代抑郁樣行為的機制研究 2.雌激素缺乏所致抑郁樣和焦慮樣行為的機制研究

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【摘要】：抑郁癥是一種常見的慢性精神系統(tǒng)疾病,其發(fā)病機制非常復雜,至今尚未完全闡明。隨著成人疾病胎兒起源學說的提出,越來越多的研究證實,很多精神系統(tǒng)疾病的病因可以追溯至胎兒期。胎兒期母體所受各種不良環(huán)境應激,可以導致胎兒體內(nèi)糖皮質(zhì)激素(GCs)水平升高。而過早、過量的GCs暴露能夠編程并改變腦內(nèi)某些關鍵基因的表達,增加其成年后罹患抑郁癥、焦慮等精神系統(tǒng)疾病風險。此外,臨床上對于具有早產(chǎn)風險的孕婦都會給予人工合成的糖皮質(zhì)激素——地塞米松(DEX),以促進胎兒肺成熟、降低呼吸窘迫綜合征發(fā)生率和早產(chǎn)兒死亡率。然而,流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),妊娠后期暴露過量人工合成的GCs,其子代成年后罹患精神系統(tǒng)疾病、情感障礙等問題的風險大大增加。而妊娠后期暴露過量GCs對子代抑郁樣行為具有怎樣的影響?這種影響能否跨代傳遞?其機制又是如何?目前并不十分清楚。因此,本課題的第一部分,我們首先構建了妊娠后期暴露過量GCs大鼠模型,待其子代成年后運用糖水消耗實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗和曠場實驗檢測其行為改變情況。行為學測試結束后將部分成年F1代兩兩交叉繁殖成F2代,待其成年后再次檢測行為改變情況。與此同時,運用高通量全基因組表達譜芯片篩選出模型大鼠腦內(nèi)抑郁關鍵分子,并運用分子生物學實驗技術探究妊娠后期暴露過量GCs對子代腦區(qū)關鍵分子表達調(diào)控及抑郁樣行為跨代傳遞的機制。臨床研究證實,婦女體內(nèi)雌激素急劇下降的月經(jīng)期和圍絕經(jīng)期,其情緒紊亂如焦慮、抑郁狀態(tài)迅速增加。同時,絕經(jīng)期婦女抑郁評分與血漿雌二醇水平呈顯著負相關,而給予雌激素替代治療能夠改善其情緒紊亂癥狀。提示,抑郁癥與血清雌激素水平密切相關。目前,臨床和動物實驗雖已證實雌激素參與調(diào)節(jié)機體的情緒反應,但其機制仍未完全闡明。因此,在本課題的第二部分,我們通過去卵巢手術構建雌激素缺乏動物模型,借此觀察雌激素缺乏對動物抑郁樣行為的影響。然后通過雌激素、不同類型雌激素受體激動劑和炎性小體抑制劑替代治療,觀察其對去卵巢小鼠抑郁樣和焦慮樣行為的影響。在此基礎上,運用分子生物學方法研究雌激素抗抑郁、抗焦慮效應的分子機制。主要實驗結果如下:第一部分妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素所致子代抑郁樣行為的機制研究一、妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素所致子代抑郁樣行為及其跨代傳遞首先,構建妊娠后期暴露過量GCs子代大鼠模型。F0代SD孕鼠妊娠GD14-GD21天,腹部皮下注射0.1mg/kg DEX,對照組(Con)注射等量的生理鹽水。每天一次,直至分娩。F1代大鼠成年時(9周齡),運用糖水消耗實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗和曠場實驗檢測其行為改變情況。行為學實驗結束后,將部分成年F1代兩兩交叉繁殖成F2代,待其成年后再次檢測其行為改變情況。(一)妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素導致成年F1代抑郁樣行為增加F1代大鼠行為學實驗結果顯示:與Con組相比,DEX組大鼠糖水消耗百分比降低,強迫游泳和懸尾實驗中不動時間增加,曠場實驗中中央活動路程和穿梭次數(shù)減少,且無性別差異。表明,妊娠后期暴露過量GCs導致成年F1代大鼠抑郁樣行為增加。(二)妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素所致子代抑郁樣行為的跨代傳遞F2代大鼠行為學實驗結果顯示:與Con♂/Con♀組相比,Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀組大鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為,如糖水消耗百分比降低,懸尾實驗中不動時間增加,曠場實驗中中央活動路程和穿梭次數(shù)減少。DEX♂/Con♀組大鼠糖水消耗百分比降低,但在懸尾實驗和曠場實驗中其行為均未發(fā)生明顯改變。以上行為學實驗結果表明,妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素F1代大鼠抑郁樣行為主要通過母親傳遞到F2代。二、妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素所致子代抑郁樣行為及其跨代傳遞的機制(一)妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素F1代大鼠海馬CRH、CRHR1表達增加1.全基因組表達譜芯片篩選海馬腦區(qū)差異表達基因全基因組表達譜分析結果顯示:雄性F1代Con組、DEX組大鼠海馬與腦功能相關基因CRH、5-HT1A、Olr840、Olr232、Aldh1a2和Ubd的表達均發(fā)生明顯改變。Real-time PCR結果表明:DEX組大鼠海馬CRH m RNA表達較Con組明顯增加,且無性別差異。而Aldhla2、Olr840、Olr232和Ubd m RNA表達存在明顯的性別差異,這一結果與F1代DEX組大鼠抑郁樣行為無明顯性別差異相矛盾。提示,Aldhla2、Olr840、Olr232和Ubd不是妊娠后期暴露過量GCs所致子代抑郁樣行為的關鍵基因。2.妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素子代海馬CRH、CRHR1表達增加Real-time PCR和Western blot結果顯示:成年和E18天F1代DEX組大鼠海馬CRH、CRHR1 m RNA和蛋白表達較Con組明顯升高且無性別差異,而CRHR2 m RNA和蛋白表達均無明顯改變。提示,海馬CRH、CRHR1參與妊娠后期暴露過量GCs所致子代抑郁樣行為增加。(二)海馬CRHR1高表達導致大鼠抑郁樣行為增加1.CRHR1特異性拮抗劑CP154526能夠改善妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素所致子代大鼠的抑郁樣行為F1代DEX組大鼠出生后第2天起,每天一次皮下注射CRHR1特異性拮抗劑CP154526,對照組注射等量的生理鹽水,連續(xù)給藥7天,待其成年后觀察抑郁樣行為。結果發(fā)現(xiàn):與Con組相比,注射CP154526后DEX組大鼠抑郁樣行為明顯改善且無性別差異。如糖水消耗百分比增加,強迫游泳和懸尾實驗中不動時間減少,曠場實驗中中央活動路程增加。2.海馬CRHR1過表達大鼠抑郁樣行為增加正常雄性SD大鼠海馬注射CRHR1過表達慢病毒載體,4周后分別運用Western blot方法檢測海馬CRHR1表達和行為學實驗方法檢測其抑郁樣行為。結果顯示:海馬注射過表達CRHR1慢病毒4周后,CRHR1表達明顯增加。同時,糖水消耗百分比降低,懸尾實驗中不動時間增加,曠場實驗中中央活動路程和穿梭次數(shù)減少。提示,海馬CRHR1過表達能夠?qū)е聞游锉憩F(xiàn)出明顯的抑郁樣行為。(三)F1代海馬CRHR1高表達能夠通過母親傳遞到F2代Real-time PCR和Western blot方法分別檢測F2代E18和成年時海馬CRH、CRHR1表達。結果顯示:F2代Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀組大鼠海馬CRH和CRHR1表達增加,而CRHR2表達并未發(fā)生明顯改變。以上實驗結果提示,F1代海馬CRH和CRHR1高表達可以通過母親傳遞到F2代。(四)妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素子代大鼠海馬CRHR1高表達及其跨代傳遞的機制1.妊娠后期暴露過量糖皮質(zhì)激素F1代大鼠海馬CRHR1啟動子區(qū)特異Cp G位點甲基化水平降低F1代海馬整體甲基化檢測結果表明,DEX組大鼠海馬整體甲基化水平較Con組明顯降低。BSP法分析F1代雄性大鼠海馬CRH、CRHR1啟動子區(qū)Cp G島內(nèi)胞嘧啶甲基化水平的結果顯示:與Con組相比,DEX組大鼠海馬CRHR1啟動子區(qū)-833和+13 Cp G位點甲基化水平明顯降低,而CRH啟動子區(qū)所有Cp G位點的甲基化水平無明顯改變。提示,妊娠后期暴露過量GCs所致子代海馬CRHR1表達增加可能是由于其啟動子區(qū)Cp G位點低甲基化造成的,而CRH表達增加不受甲基化方式調(diào)控。2.F1代CRHR1啟動子區(qū)低甲基化可以通過母親傳遞到F2代F2代海馬腦區(qū)整體甲基化水平檢測結果表明:與Con♂/Con♀組相比,Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀組大鼠海馬整體甲基化水平明顯降低,而雌性F2代DEX♂/Con♀組大鼠海馬整體甲基化水平明顯升高。進一步,用BSP法對F2代CRHR1啟動子區(qū)進行分析發(fā)現(xiàn),Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀組大鼠海馬-732、-671、-527-128、-76和-10 Cp G位點甲基化水平明顯降低。以上結果提示,F1代CRHR1啟動子區(qū)低甲基化可以通過母親傳遞到F2代。3.DEX通過抑制海馬腦片DNA甲基化上調(diào)CRHR1表達Real-time PCR和Western blot結果顯示:DEX能夠劑量依耐性上調(diào)海馬腦片CRH、CRHR1的表達,而對CRHR2 m RNA表達無顯著影響。同時,DEX能夠降低海馬腦片整體甲基化水平。甲基化轉(zhuǎn)移酶激動劑3ABA能夠顯著降低CRHR1 m RNA表達并能逆轉(zhuǎn)DEX上調(diào)海馬腦片CRHR1的作用,但對CRH的表達無顯著影響。以上結果表明,DEX上調(diào)CRHR1表達確實是由于海馬基因組低甲基化引起的。生物信息學分析CRHR1啟動子區(qū)Cp G位點結果顯示:+13 Cp G位點可能是熱休克蛋白HSP的結合位點。為了驗證該位點甲基化對基因轉(zhuǎn)錄的影響,我們分別構建含有該位點和突變該位點的熒光素酶報告基因分別轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元細胞系——HT22細胞系。結果顯示:與轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒后的熒光素酶活力相比,轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒后其熒光素酶活力降低約70%。以上實驗結果表明,CRHR1啟動子區(qū)+13 Cp G位點低甲基化是導致妊娠后期暴露過量GCs所致海馬CRHR1表達增加的重要機制。4.F1代DEX組大鼠血清皮質(zhì)酮增加的跨代傳遞可導致海馬低甲基化F1代、F2代血清皮質(zhì)酮檢測結果表明:與對照組相比,F1代DEX組、F2代Con♂/DEX♀和DEX♂/DEX♀組E18時血清皮質(zhì)酮顯著升高。這一結果提示,妊娠后期暴露過量GCs子代大鼠高濃度血清皮質(zhì)酮的跨代傳遞是通過母親傳遞的。海馬腦片培養(yǎng)結果表明:皮質(zhì)酮能夠劑量依耐性上調(diào)海馬CRH和CRHR1的表達,而對CRHR2m RNA表達無顯著影響。同時,皮質(zhì)酮可以顯著降低海馬腦片整體甲基化水平。提示,妊娠后期暴露過量GCs子代大鼠海馬CRHR1啟動子區(qū)低甲基化跨代傳遞與血液皮質(zhì)酮水平升高有關。(五)F2代大鼠血清皮質(zhì)酮水平升高的機制1.F1代DEX組大鼠HPA軸過度激活血清皮質(zhì)酮檢測結果表明:雌性F1代DEX組大鼠無論與雄性Con組、DEX組交配,其妊娠第18天時血清皮質(zhì)酮較對照組顯著升高,且在整個妊娠過程中持續(xù)保持高濃度。Real-time PCR和Western blot結果表明:F1代DEX組大鼠下丘腦CRH m RNA和蛋白表達顯著增加,海馬GR m RNA和蛋白表達顯著降低。以上實驗結果表明:F1代血清高濃度皮質(zhì)酮損傷海馬腦區(qū)和HPA軸負反饋,從而使HPA軸過度激活,導致雌性F1代妊娠期間持續(xù)保持高濃度的血清皮質(zhì)酮水平。2.雌性F1代妊娠時胎盤11β-HSD1表達增加分別運用Real-time PCR和Western blot方法檢測F2代胎盤E18時11β-HSD1、11β-HSD2的表達情況。結果發(fā)現(xiàn),F2代Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀組大鼠E18時胎盤11β-HSD1 m RNA和蛋白水平顯著增加,而DEX♂/Con♀組則表達降低。而各組胎盤11β-HSD2 m RNA和蛋白表達無顯著差異。第二部分雌激素缺乏所致抑郁樣和焦慮樣行為的機制研究(一)ERβ激動劑DPN能夠改善OVX小鼠抑郁樣和焦慮樣行為首先,構建OVX小鼠模型。OVX手術一周后,將OVX小鼠隨機分為OVX組、OVX-E2(10μg/kg)組、OVX-E2(30μg/kg)組、OVX-PPT(10μg/kg)組、OVX-PPT(30μg/kg)組、OVX-DPN(10μg/kg)組、OVX-DPN(30μg/kg)組,每天一次腹部皮下注射0.1ml 17β-雌二醇E2、雌激素α受體激動劑PPT、雌激素β受體激動劑DPN,Sham組、OVX組注射等量的芝麻油,連續(xù)給藥4周后運用糖水消耗實驗、懸尾實驗檢測其抑郁樣行為。1.ERβ激動劑DPN能夠改善OVX小鼠抑郁樣行為行為學實驗結果顯示:與Sham組相比,OVX組小鼠糖水消耗百分比顯著降低,懸尾不動時間增加。E2(10μg/kg、30μg/kg)、DPN(30μg/kg)可以增加OVX小鼠糖水消耗百分比。OVX小鼠連續(xù)給予30μg/kg E2和DPN 4周能夠顯著降低懸尾不動時間,而10μg/kg E2和DPN對懸尾實驗不動時間無顯著影響。PPT(10μg/kg、30μg/kg)對OVX小鼠的抑郁樣行為均無顯著影響。2.ERβ激動劑DPN能夠改善OVX小鼠焦慮樣行為行為學實驗結果顯示:在EZM實驗中,OVX組小鼠在開放臂活動時間和進入開放臂活動次數(shù)較Sham組明顯減少。OVX組小鼠連續(xù)給予E2和DPN(30μg/kg)4周能夠顯著增加其在開放臂活動時間、進入開放臂的次數(shù)。連續(xù)給予10μg/kg E2和DPN 4周能分別增加動物在開放臂的活動時間和進入開放臂活動的次數(shù)。在OFT實驗中,OVX組小鼠中央活動路程、中央活動時間和穿越次數(shù)較Sham組顯著減少。OVX組小鼠連續(xù)給予E2和DPN(30μg/kg)4周能夠顯著增加中央活動路程、穿越次數(shù)和中央活動時間。而連續(xù)給予10μg/kg E2和DPN 4周對曠場實驗相關指標均無顯著影響,PPT(10μg/kg/day、30μg/kg/day)連續(xù)給藥4周對上述行為學指標均無明顯的改善作用。(二)ERβ激動劑DPN能夠改善OVX小鼠海馬炎癥反應1.OVX小鼠海馬IL-1β和IL-18高表達可以被ERβ激動劑DPN所逆轉(zhuǎn)ELISA結果顯示:OVX組小鼠海馬IL-1β、IL-18含量較Sham組顯著增加,連續(xù)給予30μg/kg E2、DPN 4周,能顯著降低OVX組小鼠海馬IL-1β、IL-18水平,而PPT對海馬IL-1β、IL-18水平無顯著影響。Real-time PCR結果顯示:OVX組小鼠IL-1β、IL-18m RNA表達較Sham組顯著增加。連續(xù)給予30μg/kg E2、DPN 4周能夠逆轉(zhuǎn)OVX引起的海馬IL-1β、IL-18 m RNA的高表達。Western blot結果顯示:OVX小鼠海馬成熟的IL-1β、IL-18含量較Sham組顯著增加,同時,IL-1β、IL-18前體Pro-IL-1β、Pro-IL-18蛋白表達也較Sham組顯著增加。連續(xù)給予30μg/kg E2、DPN 4周能夠逆轉(zhuǎn)OVX引起的海馬Pro-IL-1β、Pro-IL-18、IL-1β和IL-18的高表達。此外,我們還探究了前額皮質(zhì)和杏仁體IL-1β、IL-18的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)OVX組小鼠前額皮質(zhì)和杏仁體IL-1β、IL-18表達較Sham組無明顯改變。而PPT、DPN給藥4周對上述腦區(qū)IL-1β、IL-18的表達無顯著影響。2.OVX小鼠海馬NLRP3炎性小體激活可以被ERβ激動劑DPN所逆轉(zhuǎn)Real-time PCR和Western blot結果顯示:與Sham組相比,OVX組小鼠海馬NLPR3m RNA和蛋白、Caspase-1 P10(激活的Caspase-1)表達顯著增加,而ASC蛋白表達無顯著改變。連續(xù)給予30μg/kg E2、DPN 4周能夠顯著降低OVX小鼠海馬NLPR3 m RNA和蛋白、Caspase-1 P10蛋白表達水平,而PPT給藥4周對NLPR3、Caspase-1 P10表達無顯著影響。3.OVX小鼠海馬TLR-2、TLR-4以及NF-κB信號通路激活可以被ERβ激動劑逆轉(zhuǎn)Western blot結果顯示:與Sham組相比,OVX組小鼠海馬TLR-2、TLR-4及其下游的My D88蛋白表達顯著增加,連續(xù)給予30μg/kg E2、DPN 4周能夠顯著降低OVX小鼠上述蛋白的表達。OVX組小鼠海馬磷酸化的p65(p-p65)較Sham組顯著增加,連續(xù)給予30μg/kg E2、DPN 4周能夠顯著降低OVX小鼠海馬p-p65含量,而PPT(30μg/kg)給藥4周對p-p65的表達無顯著影響。4.OVX小鼠海馬P2X7R、CD11b表達增加可以被ERβ激動劑所逆轉(zhuǎn)Western blot結果顯示:OVX小鼠海馬P2X7R蛋白表達較Sham組顯著增加,連續(xù)給予30μg/kg E2、DPN 4周能夠顯著降低OVX小鼠海馬P2X7R的表達,而PPT(30μg/kg)對P2X7R蛋白表達無顯著影響。同時,OVX小鼠海馬小膠質(zhì)細胞標志物CD11b的表達顯著增加,連續(xù)給予30μg/kg E2Western blot結果顯示:VX-765(25mg/kg、50 mg/kg)可以顯著降低Sham組小鼠海馬Pro-IL-18和OVX小鼠海馬IL-1β、IL-18的表達。50mg/kg VX-765可以顯著降低、DPN 4周能夠顯著降低OVX小鼠海馬CD11b的表達,而PPT則無明顯的改善作用。(三)VX-765可以逆轉(zhuǎn)OVX小鼠抑郁樣和焦慮樣行為及其炎癥反應1.VX-765可以逆轉(zhuǎn)OVX小鼠抑郁樣和焦慮樣行為行為學實驗結果顯示:VX-765可以顯著改善OVX小鼠的抑郁樣行為。如連續(xù)給予50 mg/kg VX-765 4周能夠顯著增加OVX小鼠糖水消耗百分比,VX-765(25mg/kg、50 mg/kg)連續(xù)給藥4周能顯著降低OVX小鼠懸尾實驗不動時間。同時,VX-765可以顯著改善OVX小鼠的焦慮樣行為。如連續(xù)給予25mg/kg、50mg/kg VX-765 4周增加其進入開放臂次數(shù)、時間。在曠場實驗中,VX-765(50 mg/kg)可以增加其中央活動路程、穿越次數(shù)和中央活動時間。2.VX-765可以逆轉(zhuǎn)OVX小鼠海馬IL-1β、IL-18、p-p65和CD11b的表達Sham組小鼠海馬IL-1β、IL-18和OVX小鼠海馬Pro-IL-18的表達。ELISA結果顯示:50mg/kg VX-765可以顯著降低Sham組小鼠海馬IL-1β、IL-18含量,而VX-765(25mg/kg、50 mg/kg)可以顯著降低OVX小鼠海馬IL-1β、IL-18含量。50mg/kg VX-765可以顯著降低Sham組小鼠海馬p-p65、CD11b和OVX組小鼠p-p65、CD11b的表達,而25mg/kg VX-765可以降低OVX小鼠海馬CD11b的表達。結論:1.妊娠后期暴露于過量GCs能夠?qū)е翭1代抑郁樣行為增加,并且這種抑郁樣行為可以通過母系傳遞到F2代。其機制可能與GCs導致F1代海馬低甲基化進而引起海馬CRHR1高表達有關。2.雌性F1代海馬GR表達減少使HPA軸負反饋失衡導致HPA軸持續(xù)性激活,進而導致其在妊娠過程中胎盤11β-HSD1表達增加、胎兒血清皮質(zhì)酮水平增加。高濃度血清皮質(zhì)酮通過表觀遺傳學機制上調(diào)海馬CRHR1的表達,后者導致F2代抑郁樣行為母源性增加。3.雌激素和ERβ激動劑DPN能夠改善OVX小鼠抑郁樣和焦慮樣行為。其機制可能是通過抑制OVX小鼠海馬NLRP3炎性小體,進而抑制海馬小膠質(zhì)細胞激活、降低促炎細胞因子IL-1β、IL-18表達。4.OVX能夠激活TLR-2、TLR-4及其下游的My D88、NF-κB信號通路和P2X7R。NLRP3炎性小體抑制劑VX-765能夠抑制海馬促炎細胞因子IL-1β、IL-18表達,進而改善OVX小鼠抑郁樣和焦慮樣行為。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.4

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本文編號：1264120