本文關(guān)鍵詞：鋅指蛋白ZFX在膠質(zhì)瘤和非小細胞肺癌中的功能以及PLCH1在小鼠焦慮和恐懼記憶中的功能研究

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【摘要】：X染色體連鎖的鋅指蛋白(zinc finger protein, X-linked,ZFX)是ZFX/ZFY (zinc finger protein, Y-linked, ZFY)蛋白家族的成員。哺乳動物一般都有Zfx和Zfy基因,分別位于X、Y染色體的末端,但并不位于同源區(qū)域。ZFX和ZFY與性別選擇、精子形成和特納綜合癥有關(guān)。全長型ZFX蛋白包括一個轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域,一個核定位序列和一個具有13個C2H2[Cys(2)His(2)]型鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合區(qū)。C2H2鋅指結(jié)構(gòu)是哺乳動物細胞中具有重要生理功能的常見的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之一。ZFX與哺乳動物胚胎期及成年體內(nèi)干細胞的自我更新有關(guān)。小鼠胚胎干細胞上的研究表明ZFX和MYC以及CNOT3、TRIM28形成一個基因表達調(diào)控系統(tǒng),受此調(diào)控的基因廣泛涉及細胞周期、細胞死亡及癌癥,因此ZFX在癌癥方面的功能成為了近期研究熱點。膠質(zhì)瘤是一種發(fā)生于腦或脊髓的腫瘤,最常發(fā)生部位為腦,因其細胞形態(tài)和膠質(zhì)細胞相似而被稱為膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)瘤占腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%、占腦惡性腦腫瘤的80%,是人類健康的嚴重威脅。膠質(zhì)瘤難根治、易復發(fā),目前膠質(zhì)瘤仍是醫(yī)學界的一個難題。尋找新的治療方法和藥物追在眉睫,這正是我們研究ZFX在膠質(zhì)瘤中功能的出發(fā)點。我們利用慢病毒介導的RNA干擾技術(shù)敲低ZFX研究它在膠質(zhì)瘤中的功能。MTT分析和克隆形成分析結(jié)果表明敲低ZFX有效抑制了膠質(zhì)瘤細胞系U87和U373的增殖及單細胞形成克隆的能力。用流式細胞法和衰老相關(guān)的p半乳糖苷酶染色法進一步探究發(fā)現(xiàn)敲低ZFX是通過把細胞周期阻滯在G0/G 1期、誘導細胞凋亡以及促進衰老等方面抑制膠質(zhì)瘤。相關(guān)信號通路的蛋白水平Western blot檢測表明敲低ZFX能影響Akt和MAPK/ERK信號通路。我們還建立了裸鼠皮下瘤和原位瘤模型,結(jié)果表明敲低ZFX后的膠質(zhì)瘤細胞系U87在裸鼠上形成的皮下瘤和原位瘤的腫瘤體積都遠小于對照組。我們的研究結(jié)果表明ZFX在膠質(zhì)瘤中起到促進腫瘤增殖的作用。肺癌是導致人類死亡數(shù)較多的癌癥之一。由于ZFX在肺癌組織中有調(diào)節(jié)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的功能,因此我們提出ZFX可能在肺癌中同樣起著重要功能的假設。我們用RNA干擾技術(shù)敲低ZFX研究它在非小細胞肺癌中的功能。研究結(jié)果表明敲低ZFX后抑制了非小細胞肺癌細胞系H1299的增殖和單個細胞形成克隆的能力。進一步探究發(fā)現(xiàn)敲低ZFX主要通過影響遷移、引起細胞衰老、輕度增加細胞凋亡、阻滯細胞周期在G0/G1期等方面抑制H1299的生長。蛋白含量檢測結(jié)果表明敲低ZFX改變了一些細胞周期、凋亡以及Akt、MAPK/ERK信號通路相關(guān)分子的蛋白表達水平,與抑制生長的現(xiàn)象相符。我們建立了H1299細胞系的裸鼠皮下瘤模型,結(jié)果表明敲低ZFX的干擾組的腫瘤發(fā)生率比對照組低、干擾組的腫瘤出現(xiàn)時間比對照組晚、腫瘤體積中位數(shù)也小于對照組。綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)ZFX在膠質(zhì)瘤和肺癌中都有促進腫瘤細胞增殖的作用,表明ZFX是一個潛在的治療膠質(zhì)瘤和肺癌特別是非小細胞肺癌的靶分子。磷脂酶C (phospholipase C,PLC)可以催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)水解為1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)和甘油二酯(diacylglycerol,DAG)。DAG和IP3是細胞中重要的第二信使,因此PLC被認為是許多重要信號通路的中樞,通過整合各種輸入的信號,調(diào)控PIP2、DAG和IP3的水平。PLC家族有13個成員,PLCH1是新鑒定的該家族蛋白,又稱為PLCη1。雖然PLCH1在腦內(nèi)高表達,但其在腦內(nèi)的功能目前還沒有相關(guān)的研究。鑒于磷脂酶家族的其他成員在腦的高級功能如學習、記憶和情緒調(diào)控中發(fā)揮重要作用,因此我們利用PLCH1基因敲除小鼠來研究PLCH1在記憶和焦慮方面的作用。我們首先檢測了敲除PLCH1對小鼠基本的運動協(xié)調(diào)能力的影響。開放場實驗的總活動距離表明小鼠在平整地面的運動沒有顯著受到影響。轉(zhuǎn)棒測試結(jié)果表明鼠的運動協(xié)調(diào)能力有輕微的下降。在開放場測試中,敲除PLCH1的小鼠表現(xiàn)出更加焦慮的表型,表現(xiàn)在中央?yún)^(qū)活動時間、運動距離及穿過中央?yún)^(qū)次數(shù)與野生型小鼠相比明顯減少。為了進一步檢測敲除PLCH1對焦慮的影響,我們采用了高臺十字迷宮測試。高臺十字迷宮結(jié)果顯示PLCH1敲除小鼠在高臺開放臂的時間,在開放臂移動的距離等都比野生型小鼠少,雖然一些參數(shù)統(tǒng)計起來沒有顯著差異,但趨勢和開放場實驗的焦慮傾向一致。此外我們還檢測了敲除PLCH1對小鼠恐懼記憶的影響。在恐懼訓練后半小時及10天后,敲除PLCH1的小鼠表現(xiàn)出對恐懼更強的記憶力,在實驗箱中僵直的時間比例明顯偏高。我們也用水迷宮檢測了敲除PLCH1對小鼠空間記憶的影響。經(jīng)過7天的空間記憶訓練后移除逃生平臺進行檢測,結(jié)果表明PLCH1敲除鼠首次到達平臺的時間平均值高于野生型小鼠,表明空間記憶有受損的傾向,但經(jīng)單因素方差分析統(tǒng)計無顯著差異。綜上所述敲除PLCH1后,小鼠的基本運動能力沒有顯著改變,運動協(xié)調(diào)能力有輕微下降,對傷害后短期和長期的恐懼的記憶更強,有焦慮的傾向。綜上所述,我們的初步研究結(jié)果表明：PLCH1的敲除增加了小鼠的焦慮水平,這與PLCβ1的敲除降低了小鼠的焦慮水平正好相反。
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R734.2;R749;R739.4

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