本文關(guān)鍵詞：血管性認(rèn)知功能障礙小鼠海馬組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化及氯化鋰的干預(yù)作用

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【摘要】：目的:血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment,VCI)是由各種腦血管疾病引起的以學(xué)習(xí)、記憶功能損害為主要癥狀的智能障礙綜合征,其是一種慢性進(jìn)行性疾病,可最終發(fā)展至不可逆轉(zhuǎn)的程度。隨著人口老齡化的加劇,VCI給個人、家庭以及社會帶來沉重的負(fù)擔(dān),因而尋找一種有效的治療藥物刻不容緩。近年來許多研究表明,反復(fù)腦缺血再灌注損傷是VCI的主要病因之一,因此探討反復(fù)腦缺血再灌注損傷致VCI的發(fā)病機(jī)制并尋求有效的治療藥物成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的熱點。反復(fù)腦缺血再灌注可誘導(dǎo)線粒體損傷,產(chǎn)生大量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),其可使功能異常的蛋白質(zhì)及損害的細(xì)胞器積聚,從而激活自噬(autophagy),引起細(xì)胞自噬性死亡。研究表明糖原合成酶激酶-3β/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路(glycogen synthase kinase-3β/mammalian target of rapamycin,GSK3β/m TOR)在拮抗自噬過度激活中發(fā)揮著重要的作用。氯化鋰(lithium chloride)一直用來治療躁狂-抑郁性疾病,近年來研究證實氯化鋰可改善神經(jīng)退行性疾病及急性腦損傷誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙。盡管氯化鋰對于改善認(rèn)知功能具有多種機(jī)制,但其是否通過調(diào)控GSK3β/m TOR通路而抑制自噬改善認(rèn)知功能障礙尚未見報道。我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)反復(fù)腦缺血再灌注損傷致VCI小鼠模型腹腔注射氯化鋰2mmol/kg可磷酸化GSK3β,從而抑制GSK3β的活性�；谝陨涎芯�,本實驗通過反復(fù)三次結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈法建立VCI小鼠模型,觀察小鼠術(shù)前預(yù)防性應(yīng)用氯化鋰或術(shù)后治療性應(yīng)用氯化鋰能否改善認(rèn)知功能,并進(jìn)一步探討其是否與通過激活m TOR通路而抑制自噬有關(guān)。方法:以8周齡24-26g雄性C57BL/6小鼠為研究對象,采用反復(fù)三次結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(bilateral common carotid artery,BCCA)的方法,給予腦缺血20min 再灌注10min處理,建立VCI小鼠模型。實驗1:將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和手術(shù)組,手術(shù)組按照術(shù)后不同時間點分為1d、3d、7d、14d、28d 5個亞組。將各組小鼠分別于相應(yīng)時間點處死后,采用western blot觀察VCI發(fā)病過程中m TOR、p-m TOR、Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)蛋白水平的動態(tài)變化。實驗2:將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、VCI模型組(Vehicle)、氯化鋰預(yù)防組(Pre-Li)及氯化鋰治療組(Li)。假手術(shù)組和VCI模型組給予等體積生理鹽水;氯化鋰預(yù)防組術(shù)前腹腔注射氯化鋰2mmol/kg連續(xù)7d,氯化鋰治療組術(shù)后腹腔注射氯化鋰2mmol/kg連續(xù)14d。2周后各組通過Morris水迷宮實驗進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績測試,觀察其空間認(rèn)知能力的變化。水迷宮測試結(jié)束后,采用尼氏染色觀察各組小鼠海馬組織病理學(xué)變化及透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)變化,應(yīng)用western blot觀察各組小鼠海馬m TOR、p-m TOR、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1空間認(rèn)知能力變化—水迷宮結(jié)果1.1定位航行實驗:各組小鼠尋臺潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)逐漸縮短。VCI模型組小鼠與假手術(shù)組小鼠相比,從入水到找到平臺的時間(尋臺潛伏期)明顯延長(P0.01);氯化鋰預(yù)防組及治療組小鼠較VCI模型組小鼠相比,尋臺潛伏期明顯縮短(P0.01)。1.2空間探索實驗:選用目標(biāo)象限停留時間百分比進(jìn)行測定。與假手術(shù)組相比,VCI模型組小鼠在原平臺所在象限(目標(biāo)象限)停留時間所占百分比降低(P0.01),氯化鋰預(yù)防組在原平臺所在象限停留時間百分比較VCI模型組明顯增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而氯化鋰治療組在原平臺象限停留時間雖然較VCI模型組增加,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2尼氏染色結(jié)果假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列緊密、均勻,無神經(jīng)元丟失現(xiàn)象,結(jié)構(gòu)完整,胞漿尼氏體豐富,胞核大而圓,核仁清晰可見。與假手術(shù)組相比,VCI模型組小鼠可見CA1區(qū)神經(jīng)元部分缺失,且排列疏松,神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則,胞體、胞核固縮。給予氯化鋰干預(yù)后,上述情況得到明顯改善,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失明顯減少,可見少量胞核固縮。3海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化—透射電鏡結(jié)果假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器豐富,且粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無脫顆�，F(xiàn)象,胞核完整,染色質(zhì)均勻一致。與假手術(shù)組相比,VCI模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞膜不規(guī)則,有不同程度的水腫,細(xì)胞器數(shù)量明顯減少,線粒體變少、嚴(yán)重者有空泡化現(xiàn)象,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒,細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)分布不均勻。經(jīng)氯化鋰干預(yù)后,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)得到明顯改善。4 Western blot結(jié)果4.1 VCI小鼠海馬自噬相關(guān)蛋白動態(tài)表達(dá)反復(fù)腦缺血再灌注損傷后小鼠海馬自噬相關(guān)蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯增高。P-m TOR、Beclin1蛋白表達(dá)與LC3-II/LC3-I比值于1d開始升高,14d達(dá)到高峰,并持續(xù)到本實驗觀察到的28d(P0.01)。4.2氯化鋰對VCI小鼠海馬自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響同假手術(shù)組小鼠相比,VCI模型組小鼠海馬組織p-m TOR蛋白表達(dá)輕微升高(P0.01);經(jīng)氯化鋰干預(yù)后,p-m TOR蛋白表達(dá)水平明顯升高,與VCI模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。經(jīng)氯化鋰干預(yù)后Beclin1蛋白表達(dá)與LC3-II/LC3-I比值較VCI模型組明顯降低(P0.01)。結(jié)論:本實驗通過反復(fù)腦缺血再灌注方法成功建立VCI小鼠模型,可用來評價氯化鋰對于空間認(rèn)知損害是否有效。經(jīng)氯化鋰干預(yù)后可明顯改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力,通過上調(diào)p-m TOR表達(dá)而抑制自噬,減少海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失,明顯改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損害。調(diào)節(jié)海馬自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)可能是氯化鋰腦保護(hù)、改善空間認(rèn)知功能的機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.13

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本文編號：1214539