本文關(guān)鍵詞：自閉癥相關(guān)基因Shank3在大腦皮層錐體神經(jīng)元發(fā)育中的作用機(jī)制研究

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【摘要】：背景自閉癥是一類由嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育失調(diào)而導(dǎo)致的廣泛性發(fā)育障礙疾病。其主要表現(xiàn)為社會(huì)交往障礙、言語(yǔ)發(fā)育障礙,以及行為方式刻板和興趣狹窄。近年來(lái)因自閉癥發(fā)病率逐年攀升,社會(huì)負(fù)擔(dān)大等原因已引起廣泛關(guān)注。目前,自閉癥是一類多因素導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病已得到公認(rèn),然而自閉癥的神經(jīng)發(fā)育學(xué)機(jī)制依然尚未闡明。因此,對(duì)自閉癥行為相關(guān)神經(jīng)環(huán)路的探索,尤其是從發(fā)育角度的研究已然成為探索自閉癥發(fā)病機(jī)制和治療手段的重要方向及突破口。目前對(duì)于自閉癥發(fā)病的基因?qū)W研究已取得較多進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)了眾多可能的與自閉癥發(fā)病密切相關(guān)的危險(xiǎn)基因,如MeCP2,FMR1,PTEN,NF1,UBE3A,Shank3等。其中通過(guò)對(duì)自閉癥病人的基因?qū)W研究表明,位于人染色體22q13.3上的Shank3基因突變是導(dǎo)致自閉癥發(fā)病的重要因素之一。本課題選取Shank3基因作為研究的切入點(diǎn),其編碼的興奮性突觸后致密體折疊蛋白可以與突觸后谷氨酸受體及信號(hào)分子和骨架蛋白橋聯(lián)而發(fā)揮作用。研究表明Shank3在興奮性突觸的形成和維持谷氨酸受體功能中起重要作用,并且Shank3基因敲除的小鼠可出現(xiàn)明顯的自閉樣行為。然而Shank3如何參與大腦,尤其是大腦皮層發(fā)育過(guò)程呢?以及在自閉癥模型中,Shank3如何在發(fā)育過(guò)程中累及皮層神經(jīng)元發(fā)育從而誘發(fā)自閉樣行為?解答以上問(wèn)題對(duì)于深入闡明自閉癥的發(fā)育學(xué)機(jī)制至關(guān)重要。.本課題將對(duì)此進(jìn)行探討。目的1.觀察Shank3蛋白在成年小鼠大腦皮層內(nèi)的表達(dá)分布模式及細(xì)胞化學(xué)特點(diǎn)。2.研究Shank3基因在小鼠大腦皮層不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)變化及分布特點(diǎn)。3.觀察Shank3基因?qū)π∈蟠竽X皮層錐體神經(jīng)元樹(shù)突發(fā)育的影響。4.探索Shank3基因?qū)π∈蟠竽X皮層不同發(fā)育期興奮性突觸功能的影響。方法1.利用免疫熒光染色技術(shù)觀察Shank3免疫陽(yáng)性分子在大腦皮層組織內(nèi)的分布及細(xì)胞化學(xué)特點(diǎn)。2.懫用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期小鼠大腦皮層內(nèi)Shank3 mRNA的表達(dá)量變化。3.應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期Shank3蛋白在大腦皮層內(nèi)的表達(dá)量變化。4.構(gòu)建Shank3下調(diào)質(zhì)粒,并通過(guò)胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù),觀察Shank3基因表達(dá)下調(diào)后對(duì)錐體神經(jīng)元發(fā)育的影響。5.引入Shank3B KO小鼠,應(yīng)用Golgi染色技術(shù),并通過(guò)sholl分析觀察Shank3基因敲除對(duì)不同發(fā)育期錐體神經(jīng)元樹(shù)突分支的影響。6.聯(lián)合傳統(tǒng)Golgi染色技術(shù)-共聚焦成像-Imaris重塑方法,觀察Shank3基因敲除對(duì)不同發(fā)育期錐體神經(jīng)元樹(shù)突棘的影響。7.基于Shank3 KO轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,利用離體腦片電生理膜片鉗記錄方法,探討Shank3敲除對(duì)不同發(fā)育期大腦皮層興奮性突觸功能的影響。結(jié)果1.成年小鼠大腦皮層內(nèi),Shank3免疫陽(yáng)性細(xì)胞在前扣帶回皮層(ACC)和感覺(jué)區(qū)皮層(S)內(nèi),分布廣泛且成高表達(dá);而在大腦皮層其他區(qū)域的細(xì)胞中,Shank3的表達(dá)量很低。2.成年小鼠大腦皮層中,Shank3與Ibal和GFAP在細(xì)胞中不存在共存情況;表達(dá)Shank3的細(xì)胞幾乎都表達(dá)NeuN,而表達(dá)NeuN的細(xì)胞并非全部表達(dá)Shank3;在神經(jīng)元中Shank3分子和興奮性投射神經(jīng)元的標(biāo)志物CaMKⅡ分子幾乎全部共存,而與抑制性的GABA能神經(jīng)元的標(biāo)志物GAD67分子大多不共存。3.在ACC區(qū)和S區(qū),Shank3免疫陽(yáng)性分子在錐體神經(jīng)元的胞體,頂樹(shù)突和基樹(shù)突中均有分布,而在其他區(qū)域,Shank3分子主要定位于神經(jīng)元突起中。4.小鼠在出生前其大腦皮層內(nèi)Shank3的mRNA的表達(dá)量很低,在出生后1周其表達(dá)量開(kāi)始增加,到達(dá)2周后表達(dá)量顯著增加,之后其表達(dá)趨于平穩(wěn)。從胚胎期到出生后2周,小鼠大腦皮層內(nèi)Shank3蛋白表達(dá)量穩(wěn)定且較低,從3周開(kāi)始,其表達(dá)量顯著增加,之后趨于平穩(wěn)。5.出生后1周,小鼠大腦皮層內(nèi),Shank3免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布主要集中于M2區(qū)及S區(qū),從出生后2周開(kāi)始,其免疫陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始主要集中于ACC區(qū),M區(qū)及S區(qū),到達(dá)4周其分布和成年小鼠Shank3免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布幾乎一致。6.應(yīng)用胚胎電轉(zhuǎn)方法,下調(diào)大腦皮層錐體神經(jīng)元內(nèi)Shank3基因的表達(dá)結(jié)果顯示,小鼠出生后1周,其大腦皮層錐體神經(jīng)元的形態(tài)沒(méi)有發(fā)生改變。從出生后2周開(kāi)始,錐體神經(jīng)元的形態(tài)開(kāi)始發(fā)生改變,表現(xiàn)為神經(jīng)元突起縮短,并出現(xiàn)迂回突起,到達(dá)3周該現(xiàn)象更加明顯。7.觀察不同發(fā)育期Shank3B KO小鼠大腦皮層錐體神經(jīng)元形態(tài),發(fā)現(xiàn)出生后1周Shank3B KO小鼠較正常小鼠錐體神經(jīng)元的頂樹(shù)突和基樹(shù)突長(zhǎng)度和分支數(shù)及樹(shù)突棘密度均沒(méi)有發(fā)生改變。但出生后2周的Shank3BKO小鼠較正常小鼠錐體神經(jīng)元的頂樹(shù)突和基樹(shù)突的長(zhǎng)度縮短,基樹(shù)突的分支數(shù)減少且樹(shù)突棘密度減少。到達(dá)3周后,Shank3B KO小鼠的錐體神經(jīng)元頂樹(shù)突的長(zhǎng)度顯著縮短,并且基樹(shù)突的分支數(shù)也顯著減少,基樹(shù)突和頂樹(shù)突上樹(shù)突棘數(shù)都明顯減少。8.出生后1周的Shank3B KO小鼠ACC區(qū)錐體神經(jīng)元sEPSC的幅度和頻率均無(wú)顯著變化,但AMPA受體介導(dǎo)的I-O曲線明顯左移。出生后2周的Shank3B KO小鼠ACC區(qū)錐體神經(jīng)元sEPSC的幅度和頻率均減小,但AMPA受體介導(dǎo)的I-O曲線無(wú)明顯變化。出生后3周的Shank3BKO小鼠ACC區(qū)錐體神經(jīng)元sEPSC的幅度和頻率均減小,且AMPA受體介導(dǎo)的I-O曲線明顯左移。結(jié)論1.Shank3分子在大腦皮層內(nèi)表達(dá)分布不均一,在特定區(qū)域表達(dá)量高。2.Shank3分子在大腦皮層不同發(fā)育階段,其分布模式及表達(dá)量均不同。3.在小鼠出后1周時(shí),Shank3基因?qū)Υ竽X皮層錐體神經(jīng)元的樹(shù)突發(fā)育及其功能幾乎沒(méi)有影響。4.在小鼠出生后2周及之后,Shank3基因?qū)Υ竽X皮層錐體神經(jīng)元的樹(shù)突發(fā)育及其功能影響顯著。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.94

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本文編號(hào)：1209127