本文關(guān)鍵詞：外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ECD基因?qū)Π柎暮Ｄ〉念A(yù)防作用及機制研究

  更多相關(guān)文章： p75ECD 阿爾茨海默病 Aβ AAV 肌肉轉(zhuǎn)染

【摘要】：背景和目的阿爾茨海默病是老年人最為常見的神經(jīng)退行性疾病,以進行性認(rèn)知功能減退為主要臨床特征。目前尚無有效手段或藥物來延緩或逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病的疾病進程,成為困擾醫(yī)學(xué)科研的世界性難題。β淀粉樣蛋白(Amyloid-beta,Aβ)作為阿爾茨海默病的核心致病物質(zhì),在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。有鑒于此,Aβ也成為首要治療靶點。然而,Aβ的產(chǎn)生和代謝調(diào)節(jié)機制尚不完全清楚。同時,神經(jīng)營養(yǎng)因子及其相關(guān)受體失調(diào)在散發(fā)性阿爾茨海默病的病理發(fā)生過程中具有重要的調(diào)控作用,研究表明,阿爾茨海默病患者存在神經(jīng)營養(yǎng)因子和Trk受體下調(diào)現(xiàn)象,而與之相反的是,Aβ,神經(jīng)營養(yǎng)因子前體蛋白和相關(guān)受體如proNGF、p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)和sortilin等神經(jīng)退行性信號表達(dá)上調(diào)。p75NTR通過激活不同的共受體,介導(dǎo)發(fā)育過程中神經(jīng)元存活或神經(jīng)元凋亡兩個完全相反的作用。p75NTR在生理條件下,能夠被α-腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶(tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme,TACE)水解釋放其胞外段(p75 neurotrophin receptor ectodomain,p75ECD),C端隨后被γ分泌酶進一步剪切生成胞內(nèi)段(intracellular domain,ICD)。以往研究表明,p75NTR在阿爾茨海默病病理機制中有兩方面的作用,一方面,p75NTR能夠與Aβ相結(jié)合,介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,同時可正反饋的促進Aβ過度產(chǎn)生、聚集;另一方面,p75ECD是一個生理性的神經(jīng)保護因子,我們過去的研究證實,通過腦內(nèi)基因轉(zhuǎn)染人p75ECD以提高腦內(nèi)p75ECD水平,可以減少Aβ產(chǎn)生,拮抗其神經(jīng)毒性作用,抑制Aβ腦內(nèi)沉積,表明p75ECD具有AD防治潛力。對于Aβ的清除,過去的研究主要聚焦在使藥物進入腦內(nèi)而發(fā)揮作用。然而,在抗Aβ免疫治療中,抗體進入腦內(nèi)可誘發(fā)一系列副作用,包括自身免疫性腦炎、血管源性腦水腫、揚灰效應(yīng)等。我們近期研究發(fā)現(xiàn),腦組織中約40%的Aβ能夠從腦內(nèi)流入外周循環(huán),而后被外周器官清除。Aβ外周清除是保持腦組織Aβ維持動態(tài)平衡的有效機制。從外周途徑來清除腦內(nèi)Aβ是一條更為安全和簡便的潛在途徑。因此,我們探討通過外周肌肉轉(zhuǎn)染表達(dá)p75ECD,來清除腦內(nèi)Aβ的作用和相關(guān)機制,并初步觀察評價其安全性。材料與方法我們首先通過硫磺素t實驗與透射電鏡實驗在體外水平探討p75ecd對aβ纖維的抑制聚集能力和促進已經(jīng)聚集的aβ纖維解聚能力;然后,我們通過肌肉注射aav病毒載體轉(zhuǎn)染表達(dá)p75ecd基因,將app/ps1轉(zhuǎn)基因小鼠(ad小鼠)分為p75ecd轉(zhuǎn)染表達(dá)組、轉(zhuǎn)染對照組和ad空白對照組和野生型小鼠對照組,于ad小鼠3月齡時肌肉注射aav病毒,轉(zhuǎn)染對照組注射aav-gfp(綠色熒光蛋白),所有試驗組小鼠于12月齡時通過morris水迷宮、y迷宮和曠場實驗檢測學(xué)習(xí)記憶能力情況,通過剛果紅染色、6e10免疫組織化學(xué)染色和elisa、免疫印跡等方法進行定量分析不同組間ad相關(guān)病理變化情況、beta-淀粉樣蛋白的變化情況等,觀察p75ecd對ad小鼠的預(yù)防作用,并進一步在整體水平和離體細(xì)胞培養(yǎng)水平(sh-sy5y細(xì)胞系和皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng))探討相關(guān)機制,最后觀察實驗過程中小鼠的行為、飲食等日�；顒�,通過he染色和elisa等方法檢測分析比較小鼠病理變化、體重、代謝和自身免疫水平變化情況,以初步評價外周轉(zhuǎn)染表達(dá)p75ecd的安全性。連續(xù)性變量以mean±s.e.m.表示,重復(fù)測量數(shù)據(jù)(如水迷宮逃逸潛伏時間和游泳距離)分析采用two-wayanova分析;其余多組間比較采用one-wayanova分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參檢驗。當(dāng)p0.05,我們認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.p75ecd能夠抑制aβ聚集、促進aβ纖維解聚。體外實驗中,我們通過硫磺素t實驗與透射電鏡實驗觀察p75ecd與aβ相互作用情況。實驗結(jié)果顯示,p75ecd處理后,aβ聚合物聚集的纖維稀疏、散亂,而已經(jīng)形成的aβ聚合纖維中加入p75ecd處理一段時間后,發(fā)現(xiàn)原本排列較致密的纖維發(fā)生崩解、形態(tài)結(jié)構(gòu)松散,數(shù)量減少。而等劑量的huigg-fc、fgfr4-fc卻不影響aβ的聚集和解聚。因此,研究表明p75ecd對aβ具有抑聚、解聚能力。2.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因,主要在外周肌肉組織表達(dá)、分布。研究中我們通過基因工程方法將p75ecd-fc基因整合到腺相關(guān)病毒-8(aav-8),構(gòu)建了aav-p75ecd-fc質(zhì)粒,并將該質(zhì)粒注射到3月齡ad小鼠小鼠左后肢股內(nèi)側(cè)肌,以達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。我們在注射后不同時間點檢測p75ecd-fc表達(dá)水平,免疫組化結(jié)果顯示p75ecd-fc基因在ad小鼠的左后肢肌肉中穩(wěn)定持續(xù)表達(dá),elisa檢測發(fā)現(xiàn)p75ecd在血漿中較對照組顯著升高。上述實驗表明,外周轉(zhuǎn)染p75ecd-fc基因后,肌肉是其主要表達(dá)部位,表達(dá)的p75ecd-fc蛋白主要分布在外周,未進入腦內(nèi)。3.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因改善app/ps1小鼠認(rèn)知功能我們通過morris水迷宮、y迷宮和曠場實驗等行為學(xué)實驗檢測發(fā)現(xiàn),與gfp對照組相比較,p75ecd-fc組ad小鼠表現(xiàn)更佳,具體體現(xiàn)在morris水迷宮中逃逸潛伏期和平臺逃逸距離顯著降低,y迷宮實驗中自發(fā)交替反應(yīng)次數(shù)和新臂進入次數(shù)明顯增加,曠場實驗中小鼠移動距離更長。行為學(xué)實驗表明外周轉(zhuǎn)染p75ecd能夠顯著改善ad小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,工作記憶能力和自主探索能力,小鼠認(rèn)知功能損害得到了修復(fù)。4.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因降低app/ps1小鼠aβ水平剛果紅和免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)p75ecd組小鼠皮層和海馬內(nèi)的aβ斑塊明顯減少,elisa分析發(fā)現(xiàn)可溶性aβ、疏松aβ纖維斑塊、致密aβ斑塊和血漿中aβ變化與免疫組化結(jié)果保持一致。bace1是aβ代謝過程中的限速酶,可以和γ-分泌酶一起將app剪切生成aβ。實驗中發(fā)現(xiàn)p75ecd能夠抑制bace1表達(dá)及其活性,減少app的aβ代謝途徑。western-blot檢測發(fā)現(xiàn)aβ的主要降解酶(nep,ide)和主要跨血腦屏障轉(zhuǎn)運蛋白(lrp、rage)均未見明顯改變。原代神經(jīng)元培養(yǎng)實驗中,aβ42能夠顯著促進bace1和sapp表達(dá),兩者之間存在著劑量依賴關(guān)系。如果加入重組的p75ecd-fc或敲除p75ntr基因,這種效應(yīng)便會不復(fù)存在。以上實驗結(jié)果表明,p75ntr參與了app的aβ代謝途徑,是aβ上調(diào)bace1表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵受體,在aβ-bace1惡性循環(huán)中發(fā)揮了重要作用,促進了ad的發(fā)生發(fā)展,而p75ecd能夠阻斷aβ-bace1惡性循環(huán)。5.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因減輕app/ps1小鼠tau磷酸化水平免疫組化圖片和分析結(jié)果顯示,p75ecd組ad小鼠海馬tau-phospho-ser396陽性神經(jīng)元面積比對照組顯著降低,這與wb分析其他tau磷酸化位點(serine396,262,199,threonine231)得到的結(jié)果相一致。通過sh-sy5y細(xì)胞實驗,我們發(fā)現(xiàn)aβ能夠上調(diào)gsk3β活性而加劇tau過度磷酸化,重組的p75ecd可以競爭性與aβ結(jié)合而抑制tau磷酸化反應(yīng)。6.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因抑制app/ps1小鼠炎癥反應(yīng)gfap和cd45免疫組化染色結(jié)果顯示,p75ecd組ad小鼠大腦皮層和海馬中活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞陽性面積明顯少于對照組。p75ecd組腦組織tbs提取物和血漿中的炎癥因子(il-1β,il-6,ifn-γ和tnf-α)水平均呈下降趨勢,說明p75ecd可以抑制ad小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化,減輕炎癥反應(yīng)。7.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因預(yù)防ad途徑安全整個動物實驗過程中,所有動物健康狀況良好,未出現(xiàn)死亡或明顯行為異常。我們在本研究中專門評價了外周轉(zhuǎn)染p75ecd后小鼠腦和外周器官可能存在的副作用,he染色未發(fā)現(xiàn)大腦皮層、海馬,肝、肺、腎、脾、肌肉和小腸等主要器官存在異常病理變化。動物飲食、體重和代謝酶(AST,ALT)也未見明顯差異。另外,為了評估p75ECD受否會導(dǎo)致自身免疫反應(yīng),我們通過ELISA檢測了p75ECD組、GFP對照組和野生型小鼠血漿中p75ECD自身抗體(p75ECD-Ab)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組之間無顯著差異,且p75ECD-Ab水平很低。這些資料說明p75ECD在體內(nèi)長期表達(dá)沒有對小鼠機體帶來明顯的副作用,表明AAV外周轉(zhuǎn)染p75ECD防治AD的方法是安全的。結(jié)論1.p75ECD能夠抑制Aβ聚集、促進Aβ纖維解聚。2.AD小鼠外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ECD基因后能夠有效清除腦內(nèi)Aβ,并減輕AD相關(guān)病理損害,改善學(xué)習(xí)記憶障礙。3.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ECD基因是一條潛在的安全有效的AD防治途徑。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 逢迎春　,王壽先,宋保華;早年生活危險因素與阿爾茨海默病的發(fā)生[J];國外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊);2000年06期

2 ;阿爾茨海默病患者常有額葉損害[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2000年03期

3 柴延豐,陳哲宇;阿爾茨海默病研究又有新進展[J];中國神經(jīng)科學(xué)雜志;2000年04期

4 菲琳;;可緩解阿爾茨海默病病情的新藥[J];國外醫(yī)學(xué)情報;2000年02期

5 汪義朋,王建枝;早老素-1對阿爾茨海默病相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)的可能途徑[J];中華神經(jīng)科雜志;2001年01期

6 邵千里;15例阿爾茨海默病的診治[J];貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2001年03期

7 ;工業(yè)化社區(qū)阿爾茨海默病發(fā)病率較高[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2001年03期

8 邵梅,湯薈冬;阿爾茨海默病天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶研究進展[J];上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年05期

9 ;腦器質(zhì)性精神障礙[J];國外科技資料目錄.醫(yī)藥衛(wèi)生;2001年04期

10 吳傳深 ,周東豐 ,Peter Como ,張林 ,Karl Kieburtz ,范金虎 ,喬友林;河南林縣阿爾茨海默病患病率的調(diào)查[J];中華精神科雜志;2002年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳梅芳;;阿爾茨海默病的行為和精神癥狀及相關(guān)因素分析[A];2009年浙江省醫(yī)學(xué)會精神病學(xué)學(xué)術(shù)年會暨浙江省醫(yī)師協(xié)會精神科醫(yī)師分會第二屆年會論文匯編[C];2009年

2 杜麗華;;阿爾茨海默病治療[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

3 成林平;黃紹寬;李玉梅;王延平;鄧曉瑩;;維生素干預(yù)治療對阿爾茨海默病患者血漿同型半胱氨酸水平的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2007年

4 唐微韻;;阿爾茨海默病患者照料工作中的心理慰藉問題探討[A];第10次全國精神病學(xué)術(shù)交流會暨《中國民康醫(yī)學(xué)》創(chuàng)刊20周年慶典論文匯編[C];2008年

5 周東升;徐銀兒;連國民;于暢;陳中鳴;;老年人生活方式與阿爾茨海默病相關(guān)性研究[A];2013浙江省醫(yī)學(xué)會精神病學(xué)分會學(xué)術(shù)年會暨浙江省醫(yī)師協(xié)會精神科醫(yī)師分會第六屆年會論文匯編[C];2013年

6 于恩彥;;對阿爾茨海默病認(rèn)識的進展[A];2013年浙江省醫(yī)學(xué)會精神病學(xué)分會老年精神障礙學(xué)組學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

7 郭忠偉;陳煒;;~1H-MRS在阿爾茨海默病早期診治中的應(yīng)用[A];2013年浙江省醫(yī)學(xué)會精神病學(xué)分會老年精神障礙學(xué)組學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

8 于恩彥;朱俊鵬;王玨;王欣慰;譚云飛;廖崢孌;仇雅菊;汪宏;;阿爾茨海默病的“早期-全面-系統(tǒng)-長期”預(yù)防[A];第七屆全國心理衛(wèi)生學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2014年

9 崔德華;;腦衰老因素在阿爾茨海默病的發(fā)病中的所起的作用及防治[A];2009全國抗衰老與老年癡呆學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

10 陳生弟;楊紅旗;孫治坤;崔佩菁;王紅梅;;阿爾茨海默病的若干發(fā)病機制及治療新靶點研究[A];2009全國抗衰老與老年癡呆學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 編譯 姚立新;阿爾茨海默病防治:缺乏靈丹妙藥[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2010年

2 記者 劉正午;阿爾茨海默病成歐美第二大憂患[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2011年

3 長沙市第一醫(yī)院神經(jīng)醫(yī)學(xué)中心主任、主任醫(yī)師 王愛民;您了解阿爾茨海默病嗎？[N];大眾衛(wèi)生報;2012年

4 長沙市第一醫(yī)院神經(jīng)醫(yī)學(xué)中心主任、主任醫(yī)師 王愛民;門診可排查阿爾茨海默病[N];大眾衛(wèi)生報;2012年

5 本報記者 李穎;為阿爾茨海默病正名[N];科技日報;2012年

6 上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所教授 林水淼;阿爾茨海默病權(quán)變治療可延緩病情進展[N];健康報;2013年

7 吳志 李淼;警惕盯上老年人的“殺手”阿爾茨海默病[N];科技日報;2013年

8 孫琳 本報記者 李穎;你是否關(guān)注阿爾茨海默病？[N];科技日報;2014年

9 本報記者 李蘊明;阿爾茨海默病困局待解[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2014年

10 櫻子 整理;為何阿爾茨海默病患者常迷路[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2014年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 呂英茹;阿爾茨海默病的MRI結(jié)構(gòu)與功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 楊平;中國南方人群阿爾茨海默病易感基因篩查及可能機制[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 李毅;FDG和PiB PET顯像在Alzheimer's Disease早期診斷及臨床分型中的應(yīng)用研究[D];山東大學(xué);2015年

4 矯樹生;依達(dá)拉奉對阿爾茨海默病的防治作用及其機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 李工博;殺蟲劑DDT和hnRNPA1基因在阿爾茨海默病中的作用及分子機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 鄧青山;DISC1改善阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因模型鼠認(rèn)知功能的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

7 朱小群;磁共振波譜在輕度認(rèn)知功能損害和阿爾茨海默病中的應(yīng)用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

8 姜紅燕;云南漢族早發(fā)阿爾茨海默病家系的遺傳學(xué)研究[D];云南大學(xué);2015年

9 徐志鵬;糖原合成酶激酶-3β在阿爾茨海默病及2型糖尿病發(fā)病中的作用[D];華中科技大學(xué);2015年

10 李楠;人源性阿爾茨海默病噬菌體抗體庫的構(gòu)建及Aβ單鏈抗體的篩選與初步效價研究[D];鄭州大學(xué);2016年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔣剛;蟻群算法在求解阿爾茨海默病最優(yōu)微陣列上的應(yīng)用[D];四川師范大學(xué);2011年

2 周江霖;應(yīng)用點著色聚類方法識別阿爾茨海默病致病基因[D];四川師范大學(xué);2012年

3 方杰;IL-17在阿爾茨海默病中的作用及機制研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 張穎超;5-氨基吡唑-3-酮衍生物的合成及其生物活性測試[D];河北大學(xué);2015年

5 付成燕;護士對阿爾茨海默病的認(rèn)知及其影響因素的研究[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2014年

6 婁艷芳;非藥物療法干預(yù)阿爾茨海默病的臨床療效研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 郭耀鵬;親環(huán)素D抑制劑對阿爾茨海默病雜種細(xì)胞線粒體功能缺陷的保護作用[D];蘭州大學(xué);2015年

8 王婧;基于基因芯片微陣列數(shù)據(jù)的可比性識別阿爾茨海默病的候選基因[D];四川師范大學(xué);2015年

9 陳影影;對DNA微陣列數(shù)據(jù)的聚類以識別阿爾茨海默病的相關(guān)基因[D];四川師范大學(xué);2015年

10 閻艷;阿爾茨海默病及輕度認(rèn)知功能障礙患者血清相關(guān)激素水平的改變及其臨床意義[D];蘇州大學(xué);2015年

，

本文編號：1157991