本文關(guān)鍵詞：外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ECD基因?qū)Π柎暮Ｄ〉念A(yù)防作用及機(jī)制研究

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【摘要】：背景和目的阿爾茨海默病是老年人最為常見的神經(jīng)退行性疾病,以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為主要臨床特征。目前尚無有效手段或藥物來延緩或逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病的疾病進(jìn)程,成為困擾醫(yī)學(xué)科研的世界性難題。β淀粉樣蛋白(Amyloid-beta,Aβ)作為阿爾茨海默病的核心致病物質(zhì),在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。有鑒于此,Aβ也成為首要治療靶點(diǎn)。然而,Aβ的產(chǎn)生和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚。同時(shí),神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其相關(guān)受體失調(diào)在散發(fā)性阿爾茨海默病的病理發(fā)生過程中具有重要的調(diào)控作用,研究表明,阿爾茨海默病患者存在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和Trk受體下調(diào)現(xiàn)象,而與之相反的是,Aβ,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體蛋白和相關(guān)受體如proNGF、p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)和sortilin等神經(jīng)退行性信號(hào)表達(dá)上調(diào)。p75NTR通過激活不同的共受體,介導(dǎo)發(fā)育過程中神經(jīng)元存活或神經(jīng)元凋亡兩個(gè)完全相反的作用。p75NTR在生理?xiàng)l件下,能夠被α-腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶(tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme,TACE)水解釋放其胞外段(p75 neurotrophin receptor ectodomain,p75ECD),C端隨后被γ分泌酶進(jìn)一步剪切生成胞內(nèi)段(intracellular domain,ICD)。以往研究表明,p75NTR在阿爾茨海默病病理機(jī)制中有兩方面的作用,一方面,p75NTR能夠與Aβ相結(jié)合,介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,同時(shí)可正反饋的促進(jìn)Aβ過度產(chǎn)生、聚集;另一方面,p75ECD是一個(gè)生理性的神經(jīng)保護(hù)因子,我們過去的研究證實(shí),通過腦內(nèi)基因轉(zhuǎn)染人p75ECD以提高腦內(nèi)p75ECD水平,可以減少Aβ產(chǎn)生,拮抗其神經(jīng)毒性作用,抑制Aβ腦內(nèi)沉積,表明p75ECD具有AD防治潛力。對(duì)于Aβ的清除,過去的研究主要聚焦在使藥物進(jìn)入腦內(nèi)而發(fā)揮作用。然而,在抗Aβ免疫治療中,抗體進(jìn)入腦內(nèi)可誘發(fā)一系列副作用,包括自身免疫性腦炎、血管源性腦水腫、揚(yáng)灰效應(yīng)等。我們近期研究發(fā)現(xiàn),腦組織中約40%的Aβ能夠從腦內(nèi)流入外周循環(huán),而后被外周器官清除。Aβ外周清除是保持腦組織Aβ維持動(dòng)態(tài)平衡的有效機(jī)制。從外周途徑來清除腦內(nèi)Aβ是一條更為安全和簡(jiǎn)便的潛在途徑。因此,我們探討通過外周肌肉轉(zhuǎn)染表達(dá)p75ECD,來清除腦內(nèi)Aβ的作用和相關(guān)機(jī)制,并初步觀察評(píng)價(jià)其安全性。材料與方法我們首先通過硫磺素t實(shí)驗(yàn)與透射電鏡實(shí)驗(yàn)在體外水平探討p75ecd對(duì)aβ纖維的抑制聚集能力和促進(jìn)已經(jīng)聚集的aβ纖維解聚能力;然后,我們通過肌肉注射aav病毒載體轉(zhuǎn)染表達(dá)p75ecd基因,將app/ps1轉(zhuǎn)基因小鼠(ad小鼠)分為p75ecd轉(zhuǎn)染表達(dá)組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和ad空白對(duì)照組和野生型小鼠對(duì)照組,于ad小鼠3月齡時(shí)肌肉注射aav病毒,轉(zhuǎn)染對(duì)照組注射aav-gfp(綠色熒光蛋白),所有試驗(yàn)組小鼠于12月齡時(shí)通過morris水迷宮、y迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力情況,通過剛果紅染色、6e10免疫組織化學(xué)染色和elisa、免疫印跡等方法進(jìn)行定量分析不同組間ad相關(guān)病理變化情況、beta-淀粉樣蛋白的變化情況等,觀察p75ecd對(duì)ad小鼠的預(yù)防作用,并進(jìn)一步在整體水平和離體細(xì)胞培養(yǎng)水平(sh-sy5y細(xì)胞系和皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng))探討相關(guān)機(jī)制,最后觀察實(shí)驗(yàn)過程中小鼠的行為、飲食等日常活動(dòng),通過he染色和elisa等方法檢測(cè)分析比較小鼠病理變化、體重、代謝和自身免疫水平變化情況,以初步評(píng)價(jià)外周轉(zhuǎn)染表達(dá)p75ecd的安全性。連續(xù)性變量以mean±s.e.m.表示,重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)(如水迷宮逃逸潛伏時(shí)間和游泳距離)分析采用two-wayanova分析;其余多組間比較采用one-wayanova分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參檢驗(yàn)。當(dāng)p0.05,我們認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.p75ecd能夠抑制aβ聚集、促進(jìn)aβ纖維解聚。體外實(shí)驗(yàn)中,我們通過硫磺素t實(shí)驗(yàn)與透射電鏡實(shí)驗(yàn)觀察p75ecd與aβ相互作用情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,p75ecd處理后,aβ聚合物聚集的纖維稀疏、散亂,而已經(jīng)形成的aβ聚合纖維中加入p75ecd處理一段時(shí)間后,發(fā)現(xiàn)原本排列較致密的纖維發(fā)生崩解、形態(tài)結(jié)構(gòu)松散,數(shù)量減少。而等劑量的huigg-fc、fgfr4-fc卻不影響aβ的聚集和解聚。因此,研究表明p75ecd對(duì)aβ具有抑聚、解聚能力。2.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因,主要在外周肌肉組織表達(dá)、分布。研究中我們通過基因工程方法將p75ecd-fc基因整合到腺相關(guān)病毒-8(aav-8),構(gòu)建了aav-p75ecd-fc質(zhì)粒,并將該質(zhì)粒注射到3月齡ad小鼠小鼠左后肢股內(nèi)側(cè)肌,以達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。我們?cè)谧⑸浜蟛煌瑫r(shí)間點(diǎn)檢測(cè)p75ecd-fc表達(dá)水平,免疫組化結(jié)果顯示p75ecd-fc基因在ad小鼠的左后肢肌肉中穩(wěn)定持續(xù)表達(dá),elisa檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p75ecd在血漿中較對(duì)照組顯著升高。上述實(shí)驗(yàn)表明,外周轉(zhuǎn)染p75ecd-fc基因后,肌肉是其主要表達(dá)部位,表達(dá)的p75ecd-fc蛋白主要分布在外周,未進(jìn)入腦內(nèi)。3.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因改善app/ps1小鼠認(rèn)知功能我們通過morris水迷宮、y迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與gfp對(duì)照組相比較,p75ecd-fc組ad小鼠表現(xiàn)更佳,具體體現(xiàn)在morris水迷宮中逃逸潛伏期和平臺(tái)逃逸距離顯著降低,y迷宮實(shí)驗(yàn)中自發(fā)交替反應(yīng)次數(shù)和新臂進(jìn)入次數(shù)明顯增加,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠移動(dòng)距離更長(zhǎng)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明外周轉(zhuǎn)染p75ecd能夠顯著改善ad小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,工作記憶能力和自主探索能力,小鼠認(rèn)知功能損害得到了修復(fù)。4.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因降低app/ps1小鼠aβ水平剛果紅和免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)p75ecd組小鼠皮層和海馬內(nèi)的aβ斑塊明顯減少,elisa分析發(fā)現(xiàn)可溶性aβ、疏松aβ纖維斑塊、致密aβ斑塊和血漿中aβ變化與免疫組化結(jié)果保持一致。bace1是aβ代謝過程中的限速酶,可以和γ-分泌酶一起將app剪切生成aβ。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)p75ecd能夠抑制bace1表達(dá)及其活性,減少app的aβ代謝途徑。western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)aβ的主要降解酶(nep,ide)和主要跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lrp、rage)均未見明顯改變。原代神經(jīng)元培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,aβ42能夠顯著促進(jìn)bace1和sapp表達(dá),兩者之間存在著劑量依賴關(guān)系。如果加入重組的p75ecd-fc或敲除p75ntr基因,這種效應(yīng)便會(huì)不復(fù)存在。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,p75ntr參與了app的aβ代謝途徑,是aβ上調(diào)bace1表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵受體,在aβ-bace1惡性循環(huán)中發(fā)揮了重要作用,促進(jìn)了ad的發(fā)生發(fā)展,而p75ecd能夠阻斷aβ-bace1惡性循環(huán)。5.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因減輕app/ps1小鼠tau磷酸化水平免疫組化圖片和分析結(jié)果顯示,p75ecd組ad小鼠海馬tau-phospho-ser396陽(yáng)性神經(jīng)元面積比對(duì)照組顯著降低,這與wb分析其他tau磷酸化位點(diǎn)(serine396,262,199,threonine231)得到的結(jié)果相一致。通過sh-sy5y細(xì)胞實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)aβ能夠上調(diào)gsk3β活性而加劇tau過度磷酸化,重組的p75ecd可以競(jìng)爭(zhēng)性與aβ結(jié)合而抑制tau磷酸化反應(yīng)。6.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因抑制app/ps1小鼠炎癥反應(yīng)gfap和cd45免疫組化染色結(jié)果顯示,p75ecd組ad小鼠大腦皮層和海馬中活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性面積明顯少于對(duì)照組。p75ecd組腦組織tbs提取物和血漿中的炎癥因子(il-1β,il-6,ifn-γ和tnf-α)水平均呈下降趨勢(shì),說明p75ecd可以抑制ad小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化,減輕炎癥反應(yīng)。7.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ecd基因預(yù)防ad途徑安全整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中,所有動(dòng)物健康狀況良好,未出現(xiàn)死亡或明顯行為異常。我們?cè)诒狙芯恐袑ｉT評(píng)價(jià)了外周轉(zhuǎn)染p75ecd后小鼠腦和外周器官可能存在的副作用,he染色未發(fā)現(xiàn)大腦皮層、海馬,肝、肺、腎、脾、肌肉和小腸等主要器官存在異常病理變化。動(dòng)物飲食、體重和代謝酶(AST,ALT)也未見明顯差異。另外,為了評(píng)估p75ECD受否會(huì)導(dǎo)致自身免疫反應(yīng),我們通過ELISA檢測(cè)了p75ECD組、GFP對(duì)照組和野生型小鼠血漿中p75ECD自身抗體(p75ECD-Ab)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組之間無顯著差異,且p75ECD-Ab水平很低。這些資料說明p75ECD在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)沒有對(duì)小鼠機(jī)體帶來明顯的副作用,表明AAV外周轉(zhuǎn)染p75ECD防治AD的方法是安全的。結(jié)論1.p75ECD能夠抑制Aβ聚集、促進(jìn)Aβ纖維解聚。2.AD小鼠外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ECD基因后能夠有效清除腦內(nèi)Aβ,并減輕AD相關(guān)病理?yè)p害,改善學(xué)習(xí)記憶障礙。3.外周肌肉轉(zhuǎn)染p75ECD基因是一條潛在的安全有效的AD防治途徑。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：1157991