本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞頸內(nèi)動(dòng)脈移植治療血管性癡呆大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：背景與目的 成年哺乳動(dòng)物的神經(jīng)元缺乏再生能力，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central neural system，CNS)損傷后的修復(fù)相當(dāng)困難。目前人們將精力集中在干細(xì)胞移植治療腦和脊髓病變上[1-6]。胚胎干細(xì)胞移植是治療CNS疾病最有希望的手段之一[7-8]，但其受取材困難、免疫排斥和倫理學(xué)等因素的限制[9]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMesenchymal stem cells，BMSCs）是具有高度自我更新、活躍增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞[10-11]，其取自自體，抗原表達(dá)弱，引起的免疫排斥和移植物抗宿主反應(yīng)低，且來源豐富，取材簡便，易于體外分離、純化和培養(yǎng)，并增殖速度快，能夠滿足細(xì)胞移植所需數(shù)量，具有廣泛的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值。BMSCs在體外適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)后高表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如nestin、β-tubulinⅢ、MAP2、GFAP、NeuN等[12]，并定向分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞[13-20]；且在腦外傷、腦血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等方面取得了一定的效果[2-3，21-26]。血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由各種腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害引起的智能障礙綜合征，嚴(yán)重影響中老人的健康，發(fā)病率逐年上升，至今尚無特效療法。因此，積極開展BMSCs移植治療VD的基礎(chǔ)與臨床研究意義深遠(yuǎn)。本研究將BrdU標(biāo)記的BMSCs經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈輸注入VD大鼠體內(nèi)，觀察BMSCs透過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)存活、遷移和分布情況，并觀察大鼠行為和認(rèn)知功能、腦組織病理結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)探討B(tài)MSCs對腦內(nèi)周圍生長相關(guān)蛋白-43（Growth associated protein-43，GAP-43）、海馬區(qū)細(xì)胞凋亡和膽堿能系統(tǒng)以及血清神經(jīng)元特異性烯醇酶(Neuron spcific enolase，NSE)與S-100蛋白含量的影響，闡明頸內(nèi)動(dòng)脈移植BMSCs對VD大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的可行性和有效性。 方法 1．BMSCs的提取、分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增采用淋巴細(xì)胞密度梯度分離法和貼壁法。 2．BMSCs BrdU標(biāo)記在加入20ng/mLNGF、RA基礎(chǔ)上，加入BrdU使?jié)舛葹?μmol/L，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)誘導(dǎo)分化48h。 3．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組隨機(jī)分對照組(n＝126)、模型組(n＝126)和治療組(n＝126)；又分2、4、8W三個(gè)時(shí)相點(diǎn)。 4．動(dòng)物模型改良的Pulsinellis四血管阻斷法建立VD模型。治療組于術(shù)后24h頸內(nèi)動(dòng)脈輸入BMSCs，濃度為1.2×107/mL，注射劑量0.5mL。 5．腦組織內(nèi)BMSCs檢測采用S-P免疫組化法檢測BMSCs在腦內(nèi)的存活、遷移及其分布特點(diǎn)。 6．腦組織內(nèi)GAP-43和海馬區(qū)（Cholineacetyltransferase，ChAT）表達(dá)采用S-P免疫組化法。 7．海馬凋亡細(xì)胞檢測采用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（Terminaldeoxynucleotidyltransferase mediated dUPT nick end－labelling，TUNEL）法。 8．海馬區(qū)乙酰膽堿（Acetyl choline， Ach）含量和乙酰膽堿脂酶（Acetylcholinesterase，AchE）活性檢測采用Hestrin堿性羥胺比色法。 9．血清NSE和S-100蛋白水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmuno adsordent assay，ELISA)。 10．行為學(xué)檢測運(yùn)用主動(dòng)回避反應(yīng)(active avoidance reaction，AAR)檢測學(xué)習(xí)、記憶能力。 11．病理學(xué)觀察光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察大鼠腦組織病理變化。 結(jié)果 1．BMSCs培養(yǎng)24h后細(xì)胞貼壁，3~4天進(jìn)入對數(shù)增長期，呈集落樣生長，形成多個(gè)克隆團(tuán)樣結(jié)構(gòu)；10d左右80%~90%融合，下層為梭形和多角形的成纖維細(xì)胞，體積較大，約占90%左右，另有較少的小圓形多形細(xì)胞，折光率較高。傳代后細(xì)胞生長潛伏期短，增殖迅速，呈梭形或扁平，排列規(guī)則，為漩渦狀或流線形生長。BMSCs誘導(dǎo)30min后胞體變小，胞質(zhì)向核周收縮，由梭形變成圓形，折光性增強(qiáng)，伸出軸突樣突起，發(fā)出樹突樣次級分支，類似神經(jīng)元樣細(xì)胞，并與相鄰的細(xì)胞胞體或突起相連，形成類似網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)系；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，96.7%分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞。 2．BMSCs在腦實(shí)質(zhì)中廣泛分布，富含血管區(qū)域多，圍繞血管周圍；主要遷移聚集至海馬、大腦皮質(zhì)等區(qū)域，并有局灶聚集現(xiàn)象。術(shù)后2W治療組大鼠腦內(nèi)可見較多BrdU免疫陽性細(xì)胞（4151±320），4W后有所減少（2818±186），8W僅見少量存活（92±19）。 3．術(shù)后2、4、8W時(shí)，治療組大鼠腦內(nèi)GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯增多（P＞0.01）。 4．術(shù)后2、4、8W時(shí)，模型組大鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組（P㩳0.01）。術(shù)后2W時(shí)治療組大鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組（P㩳0.05），4、8W時(shí)明顯下降，與對照組無顯著差異（P㧐0.05）。術(shù)后2、4、8W時(shí)治療組大鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞比例均顯著低于模型組(P0.01)。 5．術(shù)后2、4、8W時(shí)，模型組和治療組大鼠海馬ChAT陽性細(xì)胞數(shù)均顯著低于對照組(Ｐ0.05)，但治療組均顯著高于模型組(Ｐ0.05)。 6．與對照組比較，模型組大鼠海馬Ach含量和AchE活性明顯降低(P0.01)；與模型組比較，治療組Ach含量和AchE活性明顯升高(P0.01)。 7．術(shù)后2W時(shí)模型組大鼠血清NSE含量最高，明顯高于對照組(P＜0.01)；4W時(shí)有所下降，與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，8W時(shí)降至最低，明顯低于對照組(P＜0.01)。術(shù)后2W時(shí)治療組大鼠血清NSE含量明顯低于模型組(P＜0.05)，4、8W時(shí)則明顯高于模型組(P＜0.05)，而與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。 8．術(shù)后2、4、8W時(shí)，模型組大鼠血清S-100蛋白含量明顯高于對照組(P＜0.05)；術(shù)后2、4、8W時(shí)治療組大鼠血清S-100蛋白含量均明顯低于模型組(P㩳0.01或P㩳0.05)，但與對照組比較均無顯著差異(P＞0.05)。 9．術(shù)后2、4、8W時(shí)，模型組大鼠AAR比率均明顯低于對照組，差異非常顯著(P＜0.01)，而治療組亦明顯低于對照組，但均高于模型組，差異也非常顯著(P＜0.01)。 10．各組大鼠腦組織病理學(xué)改變：模型組呈缺血缺氧性彌漫性損傷，以大腦皮質(zhì)區(qū)及海馬為主；部分細(xì)胞核可見固縮、碎裂、溶解、變性、壞死或脫失，胞漿致密，炎細(xì)胞浸潤。治療組神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死數(shù)量明顯減少，程度減輕。 結(jié)論 1．BMSCs頸內(nèi)動(dòng)脈移植可透過VD大鼠BBB遷移聚集在腦缺血易損傷部位存活，使腦內(nèi)GAP-43、海馬ChAT陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增多。表明BMSCs可促進(jìn)神經(jīng)元軸突修復(fù)、再生，有利于膽堿能神經(jīng)元分化、生長和突觸功能的重建。 2．頸內(nèi)動(dòng)脈移植BMSCs后，治療組VD大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡比例顯著低于模型組。表明BMSCs對于保護(hù)VD大鼠腦海馬神經(jīng)細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡有較好的作用。 3．BMSCs治療后VD大鼠神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死數(shù)量減少，程度明顯減輕；結(jié)合海馬區(qū)Ach含量、AchE活性以及血清NSE、S-100蛋白水平檢測結(jié)果，表明BMSCs可明顯改善VD大鼠膽堿能系統(tǒng)功能，有效減輕神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度，，對神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)、增殖及突觸聯(lián)系起到良好的保護(hù)作用。 4．頸內(nèi)動(dòng)脈移植BMSCs可顯著改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.13

【參考文獻(xiàn)】

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：1137232