發(fā)布時(shí)間：2017-11-02 16:01

  本文關(guān)鍵詞：Sigma-1受體缺乏對(duì)Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的作用及其分子機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 阿爾茨海默病(AD) sigma-1(σ_1)受體 凋亡 認(rèn)知行為 N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體

【摘要】：背景 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。由于缺乏早期預(yù)防、診斷和治療AD的有效方法和措施,預(yù)計(jì)到2050年全球的AD患者將超過9000萬人。 AD的主要病理學(xué)特征是神經(jīng)元纖維纏結(jié)、大量老年斑(senile plaque)形成和神經(jīng)元缺失。p淀粉肽(β-amyloid peptide,Aβ)是老年斑的主要成分。Aβ可以選擇性地增加N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methy-D-aspartate, NMDA)受體活性,通過增加NMDA受體通道的鈣離子內(nèi)流,引起鈣超載導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。 Sigma-1(σ1)受體是含有223個(gè)氨基酸殘基的G蛋白偶聯(lián)受體,在海馬等邊緣系統(tǒng)中高表達(dá)。大量的研究證明,σ1受體能正性調(diào)節(jié)NMDA受體。我們的前期研究已證明,σl受體激動(dòng)劑通過提高NMDA受體NR2B亞基的磷酸化水平,能增加海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的NMDA受體鈣離子內(nèi)流。而σl受體基因敲除或σ1受體拮抗劑都能降低NMDA受體NR2B亞基的磷酸化水平,從而抑制NMDA受體的功能。采用σ1受體配體的PET影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,AD腦海馬和皮層的σ1受體密度和活性明顯低于非認(rèn)知障礙人群。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),σ1受體密度降低主要發(fā)生在遲發(fā)性的AD患者腦內(nèi)。近期的臨床檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),AD患者的σ1受體具有基因多態(tài)性�；谶@些臨床資料和σ1受體生理功能的前期研究,本課題提出的科研假設(shè)是,σ1受體減少有可能會(huì)通過降低Aβ增加的NMDA受體的鈣離子內(nèi)流,減少Ap誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡——拮抗Ap的神經(jīng)毒性。 為了能明確AD腦的σ1受體密度降低是否影響Ap的神經(jīng)毒性,我們采用σ1受體基因敲除雜合子(σ1R+/-)小鼠,通過腦室內(nèi)注射Ap建立了σ1受體表達(dá)減少和功能降低的AD動(dòng)物模型。通過闡明σ1受體功能改變?cè)贏D病理過程中的作用,為AD的預(yù)防和治療新方法的開拓提供理論依據(jù)。 目的 1.確定61受體缺乏是否影響Ap損害海馬神經(jīng)元和認(rèn)知功能； 2.探討σ1受體缺乏影響Aβ神經(jīng)毒作用的分子機(jī)制。 第一部分 方法 1.基因型鑒定：提取小鼠尾部DNA,用PCR方法鑒定σ1受體基因敲除雜合子(σ1R+/-)小鼠、σ1受體基因敲除純合子(σ1R-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠。本研究采用3月齡σ1R+/-小鼠、σlR-/-小鼠和同窩WT小鼠。 2.AD動(dòng)物模型制備和動(dòng)物分組：采用聚集態(tài)的Aβ25-35(6nmol/3μl/mouse)進(jìn)行側(cè)腦室單側(cè)注射制備動(dòng)物模型。Aβ25-35-WT小鼠：Aβ25-35處理的WT小鼠；Aβ25-35-σ1R+/-小鼠：Aβ25-35處理的σ1R+/-小鼠；Aβ25-35-σ1R-/-小鼠：Aβ25-35處理的σ1-R/-小鼠。對(duì)照組小鼠給予側(cè)腦室內(nèi)注射溶劑。 3.認(rèn)知行為測(cè)試：采用Morris水迷宮和Y迷宮的檢測(cè)技術(shù)分析空間認(rèn)知功能。 4.組織細(xì)胞檢查：采用甲苯胺藍(lán)染色海馬腦片,進(jìn)行海馬CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞的體視學(xué)分析。 5.凋亡細(xì)胞的檢測(cè)：用TUNEL染色和Hoechst染色的方法,確定CAl區(qū)錐體細(xì)胞的凋亡。進(jìn)行海馬CAl凋亡細(xì)胞的體視學(xué)分析。 6.藥物處理：Ap注射后1-4天進(jìn)行σ1受體拮抗劑NE100(1mg/kg)或σl受體激動(dòng)劑PRE084(1mg/kg)的腹腔注射。 結(jié)果 1.空間認(rèn)知功能：與WT小鼠相比,σ1R+/-小鼠登臺(tái)潛伏期沒有改變,進(jìn)臂交替率也沒有改變。與WT小鼠相比,Aβ25-35-WT小鼠的登臺(tái)潛伏期顯著延長(zhǎng)和進(jìn)臂交替率明顯減少。但是與WT小鼠、σ1R+/-小鼠相比,Aβ25-35-σ1R+/-小鼠的登臺(tái)潛伏期和進(jìn)臂交替率都沒有明顯改變。 2.海馬CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)：與WT小鼠相比,σ1R+/-小鼠的錐體細(xì)胞數(shù)量沒有改變,Aβ25-35-WT小鼠的錐體細(xì)胞數(shù)量比WT小鼠減少大約25%,Aβ25-35-σ1R+/-小鼠的錐體細(xì)胞數(shù)量卻沒有明顯改變。 3.海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡：WT小鼠和σ1R+/-小鼠幾乎沒有觀察到TUNEL陽性細(xì)胞,Aβ25-35-WT小鼠的CA1區(qū)發(fā)生大量的TUNEL陽性細(xì)胞和Hoechst陽性細(xì)胞,但是在Aβ25-35-σ1R+/-小鼠的CA1區(qū)并沒有觀察到TUNEL陽性細(xì)胞和Hoechst陽性細(xì)胞。 4.在Aβ25-35-WT小鼠σ1受體拮抗劑的作用：NE100處理能改善Aβ25-35誘導(dǎo)的登臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)和進(jìn)臂交替率降低,海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞死亡。 5.在Aβ25-35-σ1R+/-小鼠σl受體激動(dòng)劑的作用：PRE084處理能加居Aβ25-35-σ1R+/-小鼠的登臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)和進(jìn)臂交替率降低,錐體細(xì)胞死亡。 結(jié)論 1.在WT小鼠,Aβ25-35腦室內(nèi)注射能損害空間認(rèn)知功能和誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元死亡。 2.σ1受體基因敲除或σl受體拮抗劑能減弱Aβ25-35損害空間認(rèn)知功能和誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元死亡。 第二部分 方法 1.電生理分析：分別在Aβ25-35處理后48小時(shí)或72小時(shí)制備海馬腦片,通過膜片鉗技術(shù)檢測(cè)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的NMDA誘導(dǎo)的電流(INMDA)。 2.Western blot：分別檢測(cè)Aβ25-35處理后48小時(shí)或72小時(shí)的海馬NR2B磷酸化。 3.藥物處理：Aβ注射后1-4天進(jìn)行NE100(1mg/kg)、NR2B阻斷劑Ro25-6981(6mg/kg)、PRE084(1mg/kg)或NMDA(30mg/kg)腹腔注射。 結(jié)果 1.海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的NMDA誘導(dǎo)電流(INMDA)：與我們?cè)讦?R-/-小鼠的前期研究報(bào)道相同,σ1R+/-小鼠的INMDA幅值比WT小鼠減少。在Aβ25-35-WT小鼠,Aβ25-35注射后48小時(shí)INMDA幅值增加約2倍,而Aβ25-35注射后72小時(shí)降低約40%。與61R+/-小鼠相比,Aβ25-35-σ1R+/-小鼠在Aβ25-35注射后48或72小時(shí)的InMDA幅值幾乎沒有明顯改變。 2.海馬CA1區(qū)NR2B磷酸化：與我們?cè)讦?R-/-小鼠的前期研究報(bào)道相同,σ1R+/-小鼠的NR2B磷酸化水平明顯低于WT小鼠。在Aβ25-35-WT小鼠,Aβ25-35注射后48小時(shí)NR2B磷酸化增加約2倍,而Aβ25-35注射后72小時(shí)明顯降低。與σlR+/-小鼠相比,Aβ25-35-σ1R+/-小鼠在Aβ25-35注射后48或72小時(shí)的NR2B磷酸化水平幾乎沒有明顯改變。 3.在Aβ25-36-WT小鼠σl受體拮抗劑的作用：NE100處理能阻止Aβ25-35注射后48小時(shí)INMDA幅值和NR2B磷酸化的增加,以及Aβ25-35注射后72小時(shí)INMDA幅值和NR2B磷酸化的降低。 4.在Aβ25-35-01R+/-小鼠σ1受體激動(dòng)劑的作用：PRE084處理能導(dǎo)致Aβ25-35注射后,48小時(shí)INMDA幅值和NR2B磷酸化的增加,以及Aβ25-35注射后72小時(shí)INMDA幅值和NR2B磷酸化的降低。 5.在Aβ25-35-WT小鼠NR2B阻斷劑的作用：to25-6981處理能改善A025-35誘導(dǎo)的登臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)和進(jìn)臂交替率降低,海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞死亡。 6.在Aβ25-35-σ1R+/-小鼠NMDA受體激動(dòng)劑的作用：NMDA處理能加劇Aβ25-35-σ1R+/-小鼠登臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)和進(jìn)臂交替率降低,海馬CA1區(qū)大量錐體細(xì)胞死亡。 結(jié)論 σ1受體缺乏通過抑制Aβ25-35增加NR2B亞基磷酸化導(dǎo)致NMDA受體過活化,阻止鈣超載發(fā)生,從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病(AD) sigma-1(σ_1)受體 凋亡 認(rèn)知行為 N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 第一部分：σ_1受體缺乏影響Aβ?lián)p害海馬神經(jīng)元和認(rèn)知功能14-37
• 前言14-15
• 材料和方法15-22
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-31
• 討論31-33
• 結(jié)論33
• 參考文獻(xiàn)33-37
• 第二部分：σ_1受體缺乏影響Aβ神經(jīng)毒性的分子機(jī)制37-58
• 前言37-38
• 材料和方法38-45
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-51
• 討論51-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 綜述58-75
• 參考文獻(xiàn)66-75
• 英文~.寫及中英文全名對(duì)照表75-77
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表研究論文及獲獎(jiǎng)情況77-78
• 致謝78

【共引文獻(xiàn)】

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7 楊媛媛;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路參與不同缺氧條件下主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1132223