本文關(guān)鍵詞：磷酸二酯酶-4介導(dǎo)的信號通路在酒精依賴中的調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：目的：酒精濫用和成癮是影響著個(gè)人和社會發(fā)展的全球性健康問題,不僅危害著飲酒者個(gè)人的身心健康,而且嚴(yán)重威脅著社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。酒精依賴是一種復(fù)雜的慢性疾病,從初次飲酒到持續(xù)飲酒,最后發(fā)展為酒精依賴,這一過程伴有神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道和受體功能及其介導(dǎo)的信號通路的神經(jīng)適應(yīng)性改變。環(huán)磷腺苷(cAMP)作為體內(nèi)極其重要的第二信使之一,其介導(dǎo)的信號通路在酒精依賴形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。急性酒精刺激直接或間接提高腺苷環(huán)化酶(AC)活性,增強(qiáng)cAMP依賴信號而產(chǎn)生急性酒精效應(yīng),但長時(shí)間反復(fù)飲酒導(dǎo)致cAMP信號通路發(fā)生適應(yīng)性改變,酒精對cAMP依賴信號刺激作用減弱,這可能與中斷飲酒后出現(xiàn)的急性酒精戒斷癥狀有關(guān)。此外,研究發(fā)現(xiàn)杏仁核內(nèi)磷酸化-cAMP-反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(pCREB)和腦神經(jīng)生長因子(BDNF)水平低下導(dǎo)致動物飲酒量和酒精偏愛度增加,這可能與pCREB和／或BDNF水平低下動物焦慮水平較高有關(guān),提高pCREB和BDNF水平可緩解焦慮癥狀并減少飲酒量和酒精偏愛度。細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的穩(wěn)態(tài)由AC和磷酸二酯酶家族(PDEs)共同調(diào)節(jié),然而關(guān)于AC-cAMP在酒精依賴中的調(diào)節(jié)作用研究已有很多,但PDEs-cAMP是否參與調(diào)節(jié)酒精依賴不得而知。PDEs包含11個(gè)家庭成員,其中磷酸二酯酶-4(PDE4)特異性水解cAMP,是調(diào)節(jié)腦內(nèi)cAMP水平穩(wěn)態(tài)最重要的酶,在阿爾茨海默病、腦缺血以及抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用�？├仗m作為PDEA選擇性抑制劑一方面可有效改善認(rèn)知損傷動物的學(xué)習(xí)記憶能力,另一方面產(chǎn)生抗焦慮抗抑郁樣作用。此外,抑制PDE4還可減少小鼠飲酒量和偏愛度。因此,基于cAMP依賴信號通路在酒精依賴中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,以及PDE4調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,本課題借以咯利普蘭作為研究PDE4工具藥,應(yīng)用多種動物模型和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究PDE4介導(dǎo)的信號通路在酒精依賴中的調(diào)節(jié)作用,具體內(nèi)容：1.PDE4在酒精獎(jiǎng)賞效應(yīng)和強(qiáng)化效應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用；2.PDE4在自行飲酒及急性酒精戒斷中的調(diào)節(jié)作用；3.PDE4在急性應(yīng)激誘發(fā)戒酒復(fù)飲行為中的調(diào)節(jié)作用。 方法：1.PDE4在酒精獎(jiǎng)賞效應(yīng)和強(qiáng)化效應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用。①PDE4抑制劑對酒精誘導(dǎo)的條件性位置偏愛(CPP)的獲得和表達(dá)的影響。CPP實(shí)驗(yàn)分為基礎(chǔ)值前測階段(1d)、條件性位置偏愛訓(xùn)練階段(2-9d)和測試階段(10d)。根據(jù)基礎(chǔ)值前測階段的結(jié)果將8周齡雄性C57BL/6J小鼠均勻隨機(jī)分為溶劑(1%DMSO)+生理鹽水組(Veh+Sal),溶劑+酒精組(Veh+EtOH),咯利普蘭0.5mg/kg+生理鹽水組(Rol+Sal),咯利普蘭0.5mg/kg+酒精組(Rol+EtOH),溶劑+生理鹽水+咯利普蘭0.5mg/kg組(Veh+Sal+Rol)和溶劑+酒精+咯利普蘭0.5mg/kg組(Veh+EtOH+Rol). Veh+Sal, Veh+EtOH, Rol+Sal和Rol+EtOH組用以評價(jià)咯利普蘭對CPP獲得的影響,在訓(xùn)練過程中給藥。Veh+Sal, Veh+EtOH, Veh+Sal+Rol和Veh+EtOH+Rol組用以評價(jià)咯利普蘭對CPP表達(dá)的影響,在測試30min前給藥。結(jié)果以對伴藥箱的偏愛度表示。②PDE4抑制劑對酒精誘導(dǎo)行為敏化(locomotor sensitivity)獲得和表達(dá)的作用。行為敏化實(shí)驗(yàn)分為基礎(chǔ)值前測階段(1-2d)、急性刺激階段(3d)、敏化階段(4-13d)和測試階段(14d)。根據(jù)基礎(chǔ)值前測階段的結(jié)果將8周齡雄性C57BL/6J小、鼠均勻隨機(jī)地分為溶劑(1%DMSO)+生理鹽水組(Veh+Sal),溶劑+酒精組(Veh+EtOH),咯利普蘭0.5mg/kg+生理鹽水組(Rol+Sal),咯利普蘭0.5mg/kg+酒精組(Rol+EtOH)和溶劑+酒精+咯利普蘭0.5mg/kg組(Veh+EtOH+Rol)。Veh+Sal, Veh+EtOH, Rol+Sal和Rol+EtOH組用以評價(jià)咯利普蘭對行為敏化獲得的影響,敏化階段進(jìn)行給藥。Veh+Sal, Veh+EtOH, Rol+Sal和Veh+EtOH+Rol組用以評價(jià)咯利普蘭對行為敏化表達(dá)的影響,在測試30min前給藥；為評價(jià)咯利普蘭對酒精吸收和代謝的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采血,采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測全血血液酒精濃度。 2.PDE4在自行飲酒和急性戒斷癥狀中的調(diào)節(jié)作用及咯利普蘭的干預(yù)作用。8周齡雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)環(huán)境1w后,單籠飼養(yǎng),自行選擇飲用10%酒精(v/v)溶液3w,根據(jù)飲酒量和酒精偏愛度將小鼠隨機(jī)分為溶劑(1%DMSO)組和咯利普蘭(0.25和0.5mg/kg)組。采用two bottle choice實(shí)驗(yàn)和drink in dark實(shí)驗(yàn)測定PDE4抑制劑對自行飲酒行為的影響。戒斷12h后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)和明暗箱實(shí)驗(yàn)以測定咯利普蘭對急性酒精戒斷引起的焦慮反應(yīng)的作用�；謴�(fù)飲酒3d后,將小鼠斷頭取腦,分離前額皮層、紋狀體和杏仁核,RT-PCR法檢測長期飲酒后腦組織內(nèi)PDE4各亞型mRNA的變化,以及咯利普蘭的干預(yù)作用；Western blotting法檢測長期飲酒對腦組織cAMP依賴信號通路的影響以及咯利普蘭的作用；HPLC法檢測PDE4酶活性。 3.PDE4在急性應(yīng)激誘發(fā)戒酒復(fù)飲行為中的調(diào)節(jié)作用。8周齡雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)環(huán)境1w后,單籠飼養(yǎng),連續(xù)給予10%酒精3w,根據(jù)飲酒量和酒精偏愛度將小鼠均勻隨機(jī)地分為Non-EtOH+Non-stress組,Non-EtOH+Stress組,EtOH+Non-stress組,EtOH+Stress組和咯利普蘭0.5mg/kg+EtOH+Stress (Rol+EtOH+Stress)組。戒酒1w后給以短時(shí)、間斷性應(yīng)激,即給以足底電擊,10min內(nèi)給以15次電擊。Two bottle choice實(shí)驗(yàn)測定急性應(yīng)激對小鼠飲酒行為的影響。為評價(jià)咯利普蘭對應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠飲酒行為的影響,在給以足底電擊錢根據(jù)分組分別給予溶劑(1%DMSO)或咯利普蘭處理。之后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)和明暗箱實(shí)驗(yàn)分別測試應(yīng)激對飲酒小鼠自主活動和焦慮水平的影響以及咯利普蘭的干預(yù)作用。行為學(xué)測試結(jié)束24h后,斷頭取腦, RT-PCR法檢測應(yīng)激對長期飲酒小鼠腦內(nèi)PDE4各亞型mRNA表達(dá)的影響以及咯利普蘭的干預(yù)作用。 結(jié)果：1.①根據(jù)CPP基礎(chǔ)值前測階段的結(jié)果,將小鼠非偏愛的白箱作為伴藥箱。經(jīng)過8天4輪回訓(xùn)練后,模型組小鼠對伴藥箱的偏愛度明顯提高,表明訓(xùn)練后小鼠建立了酒精獎(jiǎng)賞效應(yīng)與伴藥箱的關(guān)聯(lián)性,模型制作成功。與模型組相比,訓(xùn)練階段給以咯利普蘭0.5mg/kg顯著減少小鼠對伴藥箱的偏愛度,表明咯利普蘭干擾了酒精的獎(jiǎng)賞效應(yīng)。但測試前給以咯利普蘭0.5mg/kg不影響小鼠對伴藥箱的偏愛,表明咯利普蘭對已獲得的獎(jiǎng)賞效應(yīng)與伴藥箱的關(guān)聯(lián)性記憶無明顯作用。②行為敏化實(shí)驗(yàn)中,與基礎(chǔ)值相比,低劑量酒精(2.0g/kg)急性刺激顯著增加小鼠的活動次數(shù),經(jīng)過10d的高劑量酒精(2.5g/kg)敏化訓(xùn)練后,小鼠對低劑量酒精刺激反應(yīng)敏感性增加,表現(xiàn)為自發(fā)性活動明顯比敏化訓(xùn)練前增多,表明行為敏化模型制備成功。敏化訓(xùn)練過程中,給予咯利普蘭0.5mg/kg處理明顯減少低劑量酒精刺激引起的活動增加現(xiàn)象,表明咯利普蘭干擾了酒精誘導(dǎo)行為敏化的形成。然而,測試前給以咯利普蘭0.5mg/kg處理,未見顯著影響低劑量酒精刺激引起的活動增加現(xiàn)象,表明咯利普蘭對已獲得的行為敏化的表達(dá)無明顯作用。頂空-氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測全血酒精濃度結(jié)果顯示,各組小鼠血液酒精濃度之間無明顯差異,表明咯利普蘭不是通過影響酒精吸收而產(chǎn)生作用的。 2.經(jīng)訓(xùn)練飲酒3w后,C57BL/6J小鼠飲酒量和酒精偏愛度明顯提高并維持在較高水平。兩瓶實(shí)驗(yàn)中,咯利普蘭0.25和0.5mg/kg均減少飲酒量和降低酒精偏愛度,但不影響總液體攝取量,提示咯利普蘭減少飲酒并非通過抑制活動所致。在黑暗中飲酒實(shí)驗(yàn)中,4h內(nèi)小鼠飲酒量為4.31±0.56g/kg,咯利普蘭0.25和0.5mg/kg均顯著減少小鼠的飲酒量。曠場實(shí)驗(yàn)中,與未飲酒小鼠相比,酒精戒斷小鼠在敞箱中央的活動次數(shù)減少,但總水平活動次數(shù)和站立次數(shù)無明顯變化。在明暗箱實(shí)驗(yàn)中,酒精戒斷小鼠在明箱內(nèi)停留時(shí)間明顯縮短,暗箱穿越到明箱內(nèi)的次數(shù)也明顯減少,但從明箱內(nèi)進(jìn)入暗箱的潛伏期無明顯差異,以上結(jié)果提示酒精戒斷12h后,長期飲酒小鼠表現(xiàn)出強(qiáng)烈的焦慮樣反應(yīng)�？├仗m0.5mg/kg明顯改善酒精戒斷引起的焦慮癥狀。長期飲酒后紋狀體內(nèi)PDE4A mRNA明顯提高,而其他PDE4mRNA水平無明顯變化。長期飲酒顯著提高紋狀體內(nèi)PDE4酶活性,降低紋狀體內(nèi)CREB、ERK1/2和GSK-3β磷酸化水平,但對前額皮層內(nèi)pCREB和pERK1/2水平無明顯影響�？├仗m0.5mg/kg明顯逆轉(zhuǎn)長期飲酒導(dǎo)致紋狀體內(nèi)PDE4酶活性上調(diào)現(xiàn)象,顯著提高紋狀體內(nèi)pGSK-3β水平,僅輕微提高紋狀體內(nèi)pCREB水平,但對紋狀體內(nèi)pERKl/2和前額皮層內(nèi)CREB和ERKl/2磷酸化水平均無明顯影響。 3.連續(xù)給酒3w后,小鼠的飲酒量和酒精偏愛度均達(dá)到較高且相對穩(wěn)定的水平。戒酒1w后給予短時(shí)、間斷性足底電擊后,應(yīng)激小鼠的飲酒量和酒精偏愛度較無應(yīng)激小鼠明顯提高。然而,應(yīng)激和長期飲酒均不影響小鼠的自主活動(水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動)。明暗箱實(shí)驗(yàn)中,與未應(yīng)激小鼠相比,急性應(yīng)激小鼠在明箱內(nèi)停留時(shí)間縮短,且明暗箱穿越次數(shù)也顯著減少,但明箱穿越至暗箱內(nèi)的潛伏期無明顯差異,表明急性應(yīng)激增強(qiáng)焦慮反應(yīng)。與未飲酒小鼠相比,長期飲酒小鼠未表現(xiàn)出明顯的焦慮反應(yīng),但急性應(yīng)激顯著增加飲酒小鼠的焦慮反應(yīng)。應(yīng)激時(shí)給予咯利普蘭進(jìn)行干預(yù),小鼠在明箱內(nèi)的停留時(shí)間較給予溶劑小鼠延長,明暗箱的穿越次數(shù)也顯著增多,提示咯利普蘭有效減弱長期飲酒合并應(yīng)激引起的焦慮樣反應(yīng),但咯利普蘭對小鼠的自主活動以及抑郁樣行為無明顯作用。Real-time RT-PCR法檢測不同腦區(qū)內(nèi)PDE4mRNA的表達(dá),長期飲酒合并應(yīng)激顯著提高伏隔核內(nèi)PDE4A、4B及4D mRNA、紋狀體內(nèi)PDE4A及4D mRNA和前額皮層內(nèi)PDE4A mRNA的水平,給以咯利普蘭0.5mg/kg處理顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。單純給以應(yīng)激或飲酒僅顯著提高伏隔核內(nèi)PDE4D mRNA水平。 結(jié)論：cAMP作為體內(nèi)極其重要的第二信使之一,其介導(dǎo)的信號通路在長期酒精刺激過程中發(fā)生適應(yīng)性改變是酒精依賴形成和戒斷癥狀的分子基礎(chǔ)。我們的研究結(jié)果表明,PDE4作為調(diào)節(jié)腦內(nèi)cAMP水平最重要的水解酶,在酒精依賴形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。長期飲酒導(dǎo)致紋狀體內(nèi)PDE4mRNA水平變化,提高紋狀體內(nèi)PDE4酶活性,降低CREB、ERK1/2和GSK-3p磷酸化水平,這可能為促使并維持小鼠飲酒行為的分子機(jī)制。急性應(yīng)激更大程度上地提高了戒酒小鼠多個(gè)腦區(qū)內(nèi)PDE4mRNA水平,其中以NAc和紋狀體內(nèi)PDE4mRNA變化最為明顯,這可能與應(yīng)激導(dǎo)致戒酒小鼠飲酒量增多和焦慮水平提高有關(guān)。PDE4選擇性抑制劑咯利普蘭明顯抑制了酒精誘導(dǎo)條件性位置偏愛和行為敏化的形成,表明提高cAMP依賴信號可有效對抗酒精的獎(jiǎng)賞效應(yīng)和強(qiáng)化效應(yīng)。此外,PDE4選擇性抑制劑咯利普蘭顯著減少長期飲酒小鼠和戒酒小鼠急性應(yīng)激后的飲酒量和酒精偏愛度,緩解急性戒斷癥狀,逆轉(zhuǎn)應(yīng)激引起戒酒小鼠焦慮反應(yīng)增加現(xiàn)象。綜上所述,PDE4-cAMP信號通路在酒精依賴中發(fā)揮重要作用,但PDE4包含四個(gè)亞型,除PDE4C主要在外周組織內(nèi)表達(dá)外,其余亞型均在腦內(nèi)高度表達(dá),究竟PDE4哪個(gè)亞型在酒精依賴形成過程中發(fā)揮著最為關(guān)鍵的作用仍需進(jìn)一步研究。我們的行為學(xué)結(jié)果顯示,PDE4特異性抑制劑有良好的抗飲酒行為和抗焦慮樣作用,表明PDE4抑制劑有開發(fā)為防治酒精依賴藥物的潛能,但其確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。綜上所述,本研究不僅充實(shí)了PDE4-cAMP-PKA信號通路參與調(diào)節(jié)藥物成癮的理論基礎(chǔ),而且提供了PDE4抑制劑作防治酒精依賴形成的新治療策略。
【關(guān)鍵詞】：酒精依賴 磷酸二酯酶-4 應(yīng)激 焦慮 條件性位置偏愛 行為敏化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.62
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-24
• 第一章 PDE4在酒精獎(jiǎng)賞效應(yīng)和強(qiáng)化效應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用24-44
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-31
• 3 結(jié)果31-41
• 4 討論41-43
• 5 小結(jié)43-44
• 第二章 PDE4在自行飲酒和急性酒精戒斷中的調(diào)節(jié)作用及咯利普蘭的干預(yù)作用44-73
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法45-47
• 2 實(shí)驗(yàn)方法47-55
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-66
• 4 討論66-72
• 5 小結(jié)72-73
• 第三章 PDE4在應(yīng)激誘導(dǎo)戒酒復(fù)飲行為中的調(diào)節(jié)作用73-95
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法73-74
• 2 實(shí)驗(yàn)方法74-79
• 3 結(jié)果79-92
• 4 討論92-94
• 5 小結(jié)94-95
• 結(jié)論95-97
• 參考文獻(xiàn)97-113
• 綜述113-122
• 參考文獻(xiàn)117-122
• 附錄122-124
• 成果124-125
• 致謝125-128
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明128

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李菁 ,李躍華,袁孝如;慢性酒精攝取后大鼠伏核內(nèi)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化的變化:納洛酮翻轉(zhuǎn)作用(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2003年09期

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本文編號：1120988