本文關鍵詞：磷酸二酯酶-4介導的信號通路在酒精依賴中的調節(jié)作用

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【摘要】：目的：酒精濫用和成癮是影響著個人和社會發(fā)展的全球性健康問題,不僅危害著飲酒者個人的身心健康,而且嚴重威脅著社會和經濟的發(fā)展。酒精依賴是一種復雜的慢性疾病,從初次飲酒到持續(xù)飲酒,最后發(fā)展為酒精依賴,這一過程伴有神經遞質、離子通道和受體功能及其介導的信號通路的神經適應性改變。環(huán)磷腺苷(cAMP)作為體內極其重要的第二信使之一,其介導的信號通路在酒精依賴形成過程中發(fā)揮著關鍵作用。急性酒精刺激直接或間接提高腺苷環(huán)化酶(AC)活性,增強cAMP依賴信號而產生急性酒精效應,但長時間反復飲酒導致cAMP信號通路發(fā)生適應性改變,酒精對cAMP依賴信號刺激作用減弱,這可能與中斷飲酒后出現(xiàn)的急性酒精戒斷癥狀有關。此外,研究發(fā)現(xiàn)杏仁核內磷酸化-cAMP-反應元件結合蛋白(pCREB)和腦神經生長因子(BDNF)水平低下導致動物飲酒量和酒精偏愛度增加,這可能與pCREB和／或BDNF水平低下動物焦慮水平較高有關,提高pCREB和BDNF水平可緩解焦慮癥狀并減少飲酒量和酒精偏愛度。細胞內cAMP水平的穩(wěn)態(tài)由AC和磷酸二酯酶家族(PDEs)共同調節(jié),然而關于AC-cAMP在酒精依賴中的調節(jié)作用研究已有很多,但PDEs-cAMP是否參與調節(jié)酒精依賴不得而知。PDEs包含11個家庭成員,其中磷酸二酯酶-4(PDE4)特異性水解cAMP,是調節(jié)腦內cAMP水平穩(wěn)態(tài)最重要的酶,在阿爾茨海默病、腦缺血以及抑郁癥等中樞神經系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用�？├仗m作為PDEA選擇性抑制劑一方面可有效改善認知損傷動物的學習記憶能力,另一方面產生抗焦慮抗抑郁樣作用。此外,抑制PDE4還可減少小鼠飲酒量和偏愛度。因此,基于cAMP依賴信號通路在酒精依賴中發(fā)揮重要的調節(jié)作用,以及PDE4調節(jié)細胞內cAMP水平,本課題借以咯利普蘭作為研究PDE4工具藥,應用多種動物模型和分子生物學實驗研究PDE4介導的信號通路在酒精依賴中的調節(jié)作用,具體內容：1.PDE4在酒精獎賞效應和強化效應中的調節(jié)作用；2.PDE4在自行飲酒及急性酒精戒斷中的調節(jié)作用；3.PDE4在急性應激誘發(fā)戒酒復飲行為中的調節(jié)作用。 方法：1.PDE4在酒精獎賞效應和強化效應中的調節(jié)作用。①PDE4抑制劑對酒精誘導的條件性位置偏愛(CPP)的獲得和表達的影響。CPP實驗分為基礎值前測階段(1d)、條件性位置偏愛訓練階段(2-9d)和測試階段(10d)。根據基礎值前測階段的結果將8周齡雄性C57BL/6J小鼠均勻隨機分為溶劑(1%DMSO)+生理鹽水組(Veh+Sal),溶劑+酒精組(Veh+EtOH),咯利普蘭0.5mg/kg+生理鹽水組(Rol+Sal),咯利普蘭0.5mg/kg+酒精組(Rol+EtOH),溶劑+生理鹽水+咯利普蘭0.5mg/kg組(Veh+Sal+Rol)和溶劑+酒精+咯利普蘭0.5mg/kg組(Veh+EtOH+Rol). Veh+Sal, Veh+EtOH, Rol+Sal和Rol+EtOH組用以評價咯利普蘭對CPP獲得的影響,在訓練過程中給藥。Veh+Sal, Veh+EtOH, Veh+Sal+Rol和Veh+EtOH+Rol組用以評價咯利普蘭對CPP表達的影響,在測試30min前給藥。結果以對伴藥箱的偏愛度表示。②PDE4抑制劑對酒精誘導行為敏化(locomotor sensitivity)獲得和表達的作用。行為敏化實驗分為基礎值前測階段(1-2d)、急性刺激階段(3d)、敏化階段(4-13d)和測試階段(14d)。根據基礎值前測階段的結果將8周齡雄性C57BL/6J小、鼠均勻隨機地分為溶劑(1%DMSO)+生理鹽水組(Veh+Sal),溶劑+酒精組(Veh+EtOH),咯利普蘭0.5mg/kg+生理鹽水組(Rol+Sal),咯利普蘭0.5mg/kg+酒精組(Rol+EtOH)和溶劑+酒精+咯利普蘭0.5mg/kg組(Veh+EtOH+Rol)。Veh+Sal, Veh+EtOH, Rol+Sal和Rol+EtOH組用以評價咯利普蘭對行為敏化獲得的影響,敏化階段進行給藥。Veh+Sal, Veh+EtOH, Rol+Sal和Veh+EtOH+Rol組用以評價咯利普蘭對行為敏化表達的影響,在測試30min前給藥；為評價咯利普蘭對酒精吸收和代謝的影響,實驗結束后采血,采用頂空-氣相色譜-質譜聯(lián)用法檢測全血血液酒精濃度。 2.PDE4在自行飲酒和急性戒斷癥狀中的調節(jié)作用及咯利普蘭的干預作用。8周齡雄性C57BL/6J小鼠適應環(huán)境1w后,單籠飼養(yǎng),自行選擇飲用10%酒精(v/v)溶液3w,根據飲酒量和酒精偏愛度將小鼠隨機分為溶劑(1%DMSO)組和咯利普蘭(0.25和0.5mg/kg)組。采用two bottle choice實驗和drink in dark實驗測定PDE4抑制劑對自行飲酒行為的影響。戒斷12h后進行曠場實驗和明暗箱實驗以測定咯利普蘭對急性酒精戒斷引起的焦慮反應的作用�；謴惋嬀�3d后,將小鼠斷頭取腦,分離前額皮層、紋狀體和杏仁核,RT-PCR法檢測長期飲酒后腦組織內PDE4各亞型mRNA的變化,以及咯利普蘭的干預作用；Western blotting法檢測長期飲酒對腦組織cAMP依賴信號通路的影響以及咯利普蘭的作用；HPLC法檢測PDE4酶活性。 3.PDE4在急性應激誘發(fā)戒酒復飲行為中的調節(jié)作用。8周齡雄性C57BL/6J小鼠適應環(huán)境1w后,單籠飼養(yǎng),連續(xù)給予10%酒精3w,根據飲酒量和酒精偏愛度將小鼠均勻隨機地分為Non-EtOH+Non-stress組,Non-EtOH+Stress組,EtOH+Non-stress組,EtOH+Stress組和咯利普蘭0.5mg/kg+EtOH+Stress (Rol+EtOH+Stress)組。戒酒1w后給以短時、間斷性應激,即給以足底電擊,10min內給以15次電擊。Two bottle choice實驗測定急性應激對小鼠飲酒行為的影響。為評價咯利普蘭對應激誘導小鼠飲酒行為的影響,在給以足底電擊錢根據分組分別給予溶劑(1%DMSO)或咯利普蘭處理。之后進行曠場實驗和明暗箱實驗分別測試應激對飲酒小鼠自主活動和焦慮水平的影響以及咯利普蘭的干預作用。行為學測試結束24h后,斷頭取腦, RT-PCR法檢測應激對長期飲酒小鼠腦內PDE4各亞型mRNA表達的影響以及咯利普蘭的干預作用。 結果：1.①根據CPP基礎值前測階段的結果,將小鼠非偏愛的白箱作為伴藥箱。經過8天4輪回訓練后,模型組小鼠對伴藥箱的偏愛度明顯提高,表明訓練后小鼠建立了酒精獎賞效應與伴藥箱的關聯(lián)性,模型制作成功。與模型組相比,訓練階段給以咯利普蘭0.5mg/kg顯著減少小鼠對伴藥箱的偏愛度,表明咯利普蘭干擾了酒精的獎賞效應。但測試前給以咯利普蘭0.5mg/kg不影響小鼠對伴藥箱的偏愛,表明咯利普蘭對已獲得的獎賞效應與伴藥箱的關聯(lián)性記憶無明顯作用。②行為敏化實驗中,與基礎值相比,低劑量酒精(2.0g/kg)急性刺激顯著增加小鼠的活動次數,經過10d的高劑量酒精(2.5g/kg)敏化訓練后,小鼠對低劑量酒精刺激反應敏感性增加,表現(xiàn)為自發(fā)性活動明顯比敏化訓練前增多,表明行為敏化模型制備成功。敏化訓練過程中,給予咯利普蘭0.5mg/kg處理明顯減少低劑量酒精刺激引起的活動增加現(xiàn)象,表明咯利普蘭干擾了酒精誘導行為敏化的形成。然而,測試前給以咯利普蘭0.5mg/kg處理,未見顯著影響低劑量酒精刺激引起的活動增加現(xiàn)象,表明咯利普蘭對已獲得的行為敏化的表達無明顯作用。頂空-氣象色譜-質譜聯(lián)用法檢測全血酒精濃度結果顯示,各組小鼠血液酒精濃度之間無明顯差異,表明咯利普蘭不是通過影響酒精吸收而產生作用的。 2.經訓練飲酒3w后,C57BL/6J小鼠飲酒量和酒精偏愛度明顯提高并維持在較高水平。兩瓶實驗中,咯利普蘭0.25和0.5mg/kg均減少飲酒量和降低酒精偏愛度,但不影響總液體攝取量,提示咯利普蘭減少飲酒并非通過抑制活動所致。在黑暗中飲酒實驗中,4h內小鼠飲酒量為4.31±0.56g/kg,咯利普蘭0.25和0.5mg/kg均顯著減少小鼠的飲酒量。曠場實驗中,與未飲酒小鼠相比,酒精戒斷小鼠在敞箱中央的活動次數減少,但總水平活動次數和站立次數無明顯變化。在明暗箱實驗中,酒精戒斷小鼠在明箱內停留時間明顯縮短,暗箱穿越到明箱內的次數也明顯減少,但從明箱內進入暗箱的潛伏期無明顯差異,以上結果提示酒精戒斷12h后,長期飲酒小鼠表現(xiàn)出強烈的焦慮樣反應�？├仗m0.5mg/kg明顯改善酒精戒斷引起的焦慮癥狀。長期飲酒后紋狀體內PDE4A mRNA明顯提高,而其他PDE4mRNA水平無明顯變化。長期飲酒顯著提高紋狀體內PDE4酶活性,降低紋狀體內CREB、ERK1/2和GSK-3β磷酸化水平,但對前額皮層內pCREB和pERK1/2水平無明顯影響�？├仗m0.5mg/kg明顯逆轉長期飲酒導致紋狀體內PDE4酶活性上調現(xiàn)象,顯著提高紋狀體內pGSK-3β水平,僅輕微提高紋狀體內pCREB水平,但對紋狀體內pERKl/2和前額皮層內CREB和ERKl/2磷酸化水平均無明顯影響。 3.連續(xù)給酒3w后,小鼠的飲酒量和酒精偏愛度均達到較高且相對穩(wěn)定的水平。戒酒1w后給予短時、間斷性足底電擊后,應激小鼠的飲酒量和酒精偏愛度較無應激小鼠明顯提高。然而,應激和長期飲酒均不影響小鼠的自主活動(水平運動和垂直運動)。明暗箱實驗中,與未應激小鼠相比,急性應激小鼠在明箱內停留時間縮短,且明暗箱穿越次數也顯著減少,但明箱穿越至暗箱內的潛伏期無明顯差異,表明急性應激增強焦慮反應。與未飲酒小鼠相比,長期飲酒小鼠未表現(xiàn)出明顯的焦慮反應,但急性應激顯著增加飲酒小鼠的焦慮反應。應激時給予咯利普蘭進行干預,小鼠在明箱內的停留時間較給予溶劑小鼠延長,明暗箱的穿越次數也顯著增多,提示咯利普蘭有效減弱長期飲酒合并應激引起的焦慮樣反應,但咯利普蘭對小鼠的自主活動以及抑郁樣行為無明顯作用。Real-time RT-PCR法檢測不同腦區(qū)內PDE4mRNA的表達,長期飲酒合并應激顯著提高伏隔核內PDE4A、4B及4D mRNA、紋狀體內PDE4A及4D mRNA和前額皮層內PDE4A mRNA的水平,給以咯利普蘭0.5mg/kg處理顯著逆轉這一現(xiàn)象。單純給以應激或飲酒僅顯著提高伏隔核內PDE4D mRNA水平。 結論：cAMP作為體內極其重要的第二信使之一,其介導的信號通路在長期酒精刺激過程中發(fā)生適應性改變是酒精依賴形成和戒斷癥狀的分子基礎。我們的研究結果表明,PDE4作為調節(jié)腦內cAMP水平最重要的水解酶,在酒精依賴形成過程中發(fā)揮關鍵作用。長期飲酒導致紋狀體內PDE4mRNA水平變化,提高紋狀體內PDE4酶活性,降低CREB、ERK1/2和GSK-3p磷酸化水平,這可能為促使并維持小鼠飲酒行為的分子機制。急性應激更大程度上地提高了戒酒小鼠多個腦區(qū)內PDE4mRNA水平,其中以NAc和紋狀體內PDE4mRNA變化最為明顯,這可能與應激導致戒酒小鼠飲酒量增多和焦慮水平提高有關。PDE4選擇性抑制劑咯利普蘭明顯抑制了酒精誘導條件性位置偏愛和行為敏化的形成,表明提高cAMP依賴信號可有效對抗酒精的獎賞效應和強化效應。此外,PDE4選擇性抑制劑咯利普蘭顯著減少長期飲酒小鼠和戒酒小鼠急性應激后的飲酒量和酒精偏愛度,緩解急性戒斷癥狀,逆轉應激引起戒酒小鼠焦慮反應增加現(xiàn)象。綜上所述,PDE4-cAMP信號通路在酒精依賴中發(fā)揮重要作用,但PDE4包含四個亞型,除PDE4C主要在外周組織內表達外,其余亞型均在腦內高度表達,究竟PDE4哪個亞型在酒精依賴形成過程中發(fā)揮著最為關鍵的作用仍需進一步研究。我們的行為學結果顯示,PDE4特異性抑制劑有良好的抗飲酒行為和抗焦慮樣作用,表明PDE4抑制劑有開發(fā)為防治酒精依賴藥物的潛能,但其確切的作用機制仍需進一步研究。綜上所述,本研究不僅充實了PDE4-cAMP-PKA信號通路參與調節(jié)藥物成癮的理論基礎,而且提供了PDE4抑制劑作防治酒精依賴形成的新治療策略。
【關鍵詞】：酒精依賴 磷酸二酯酶-4 應激 焦慮 條件性位置偏愛 行為敏化
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.62
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-24
• 第一章 PDE4在酒精獎賞效應和強化效應中的調節(jié)作用24-44
• 1 實驗材料與方法25-26
• 2 實驗方法26-31
• 3 結果31-41
• 4 討論41-43
• 5 小結43-44
• 第二章 PDE4在自行飲酒和急性酒精戒斷中的調節(jié)作用及咯利普蘭的干預作用44-73
• 1 實驗材料與方法45-47
• 2 實驗方法47-55
• 3 實驗結果55-66
• 4 討論66-72
• 5 小結72-73
• 第三章 PDE4在應激誘導戒酒復飲行為中的調節(jié)作用73-95
• 1 實驗材料與方法73-74
• 2 實驗方法74-79
• 3 結果79-92
• 4 討論92-94
• 5 小結94-95
• 結論95-97
• 參考文獻97-113
• 綜述113-122
• 參考文獻117-122
• 附錄122-124
• 成果124-125
• 致謝125-128
• 統(tǒng)計學審稿證明128

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 李菁 ,李躍華,袁孝如;慢性酒精攝取后大鼠伏核內cAMP反應元件結合蛋白磷酸化的變化:納洛酮翻轉作用(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2003年09期

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本文編號：1120988