本文關鍵詞：甲基牛扁亭對阿爾茨海默氏病細胞模型的作用及其相關分子機制的研究

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【摘要】：研究背景和研究目的阿爾茨海默氏病(Alzheimer's Disease, AD)是一種慢性進行性神經(jīng)系統(tǒng)變性病,是癡呆最常見的病因。臨床上最常見的早期癥狀是很難記住最近發(fā)生的事件,即短期記憶喪失。主要癥狀為逐漸加重的認知功能障礙、記憶損傷、失語、失用、計算力損害及行為異常等。隨著全球進入人口老齡化時期,AD患者的數(shù)量也呈上升趨勢。AD顯著影響老年人的日常生活,加重家庭和社會的經(jīng)濟負擔,已經(jīng)成為社會關注的焦點。迄今為止,AD的病因及發(fā)病機制仍然不清楚,所以也無特效的治療方法。進一步明確AD的發(fā)病機制,尋求治療疾病的更有效藥物和方法,是目前亟待解決的重大問題。AD患者的大體病理改變呈彌漫性腦萎縮,尤其以顳、頂、前額葉及海馬萎縮明顯,而且這種病理改變隨著病情進展逐漸加重。鏡下最典型的病理特征為細胞外的老年斑(senile plaques, SPs)、細胞內(nèi)的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)及神經(jīng)元的丟失。老年斑是含有β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)、早老素1、早老素2、載脂蛋白E、α 1抗糜蛋白酶、α2巨球蛋白和泛素等的細胞外沉積物,神經(jīng)元纖維纏結(jié)主要由高度磷酸化的tau蛋白(一種微管相關蛋白)在細胞內(nèi)異常聚集形成。研究發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病與大腦內(nèi)Aβ異常聚集有關,Aβ寡聚體對突觸和神經(jīng)元具有損傷作用,是疾病發(fā)生發(fā)展中的關鍵所在。因此,研究Aβ對神經(jīng)細胞的毒性作用及損傷機制,有助于明確AD的發(fā)病機制,進而為尋求新的治療方法提供可靠依據(jù)及方向。自噬(autophagy)是真核細胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)。是細胞對持續(xù)性內(nèi)外刺激的非損傷性應答反應,主要起維持細胞結(jié)構(gòu)、代謝和功能的平衡的作用。根據(jù)底物進入溶酶體的途徑不同,自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的吞噬三種形式。其中我們最常見的是巨自噬。在某些因素的誘導下,胞質(zhì)內(nèi)被降解物的周圍出現(xiàn)特異性的杯狀的雙層膜結(jié)構(gòu),隨著膜延伸、閉合,最終形成雙層膜球形小泡,即自噬體。接著,自噬體外層膜與溶酶體膜(或者內(nèi)吞體膜)融合,成為自噬溶酶體。只有內(nèi)膜的自噬體在溶酶體內(nèi)被水解酶降解,其降解產(chǎn)物可被細胞再循環(huán)利用。在自噬發(fā)生過程中,LC3的修飾在膜的延伸和擴張過程中起著重要的作用。LC3B前體形成后,其C末端的5個氨基酸殘基被剪切,暴露甘氨酸殘基,轉(zhuǎn)化成胞漿可溶性形式LC3B-Ⅰ；LC3B-Ⅰ在酶的催化作用下與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺PE結(jié)合,被修飾成膜結(jié)合的LC3B-Ⅱ工脂化形式,定位于自噬前體和自噬體的雙層膜上。在哺乳動物細胞中檢測自噬體時,LC3經(jīng)常被用作特異性標記蛋白。哺乳動物雷帕霉素靶點(Mammalian target of rapamycin, mTOR)是自噬的一個主調(diào)控器。有研究表明,在哺乳動物細胞中,mTORCl激酶可能通過調(diào)節(jié)ULK1復合物的活性來抑制自噬的發(fā)生�？蓞⑴c各種生理和病理過程,其中包括衰老和神經(jīng)退行性疾病。有學者發(fā)現(xiàn),AD病人及APP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)腫脹變性的軸突中含有大量的異常聚集的自噬泡,并在這些自噬泡中檢測到Aβ、β CTF及Y-分泌酶復合物等,據(jù)此提出Aβ相關的自噬泡的異常累積是導致神經(jīng)元功能紊亂及缺失的原因,并最終導致神經(jīng)退行性病變。但自噬參與AD發(fā)生發(fā)展的具體機制尚不明確,仍需要繼續(xù)研究。MLA,是從翠雀野百合中分離的一種生物堿。研究發(fā)現(xiàn)MLA可以結(jié)合到煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)的α銀環(huán)蛇毒素位點上,是一種非常強效的特異性的nAChR配體,其拮抗作用具有特異性、可逆性、濃度依賴性等特點。在AD患者大腦的新皮質(zhì)和海馬部位,乙酰膽堿能受體(AChR)也減少,尤其是a7型煙堿型乙酰膽堿受體(a7-nAChR)。有研究發(fā)現(xiàn)Aβ是先在細胞內(nèi)產(chǎn)生,隨后被轉(zhuǎn)運到細胞外,聚集沉積后形成老年斑,而細胞外聚集的異常蛋白Aβ可與細胞膜上α7nAchRs結(jié)合,通過細胞的內(nèi)吞作用進入胞內(nèi),最終經(jīng)由自噬-溶酶體系統(tǒng)降解。a 7nAChR在AD患者腦內(nèi)的老年斑內(nèi)聚集,并在Aβ聚集的神經(jīng)元內(nèi)與之共存,但具體機制不清。依據(jù)上述背景,本研究以MLA為工具,通過干預AD細胞模型,觀察其自噬改變并研究自噬在其中發(fā)揮的作用及參與調(diào)控的相關因子。這有助于明確AD的發(fā)病機制,進而為尋求新的治療方法提供可靠依據(jù)及方向。研究內(nèi)容1. 研究外源性的Aβ25-35對SH-SY5Y細胞的毒性作用。2. 研究外源性的Aβ25-35是否能夠誘導SH-SY5Y細胞自噬及可能的作用機制。3. 研究外源性的Aβ2-35誘導SH-SY5Y細胞的毒性及自噬的相關性。4. 研究MLA是否可以保護SH-SY5Y細胞拮抗Aβ的毒性作用。5. 研究MLA是否可以拮抗Aβ誘導的SH-SY5Y細胞自噬及相關作用機制。研究方法1.AD細胞模型的構(gòu)建、培養(yǎng)：人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)正常培養(yǎng),老化處理的Aβ25-35進行外源性干預,從而構(gòu)建AD細胞模型。2.細胞存活率的檢測：MTT法檢測細胞存活率。3.細胞凋亡的檢測：3.1流式檢測,觀察細胞凋亡情況。3.2 Hoechest33258染色結(jié)合熒光顯微鏡,觀察細胞核凝集。4.細胞自噬的檢測：4.1電鏡觀察細胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量及分布。4.2通過檢測LC3-Ⅱ蛋白水平明確自噬是否被誘導。4.3通MDC染色在熒光顯微鏡下觀察細胞中酸性膜泡的數(shù)量及分布。5.siRNA干擾：通過beclin 1 siRNA對細胞進行干擾,降低beclin 1在細胞中的表達水平。6.細胞蛋白表達水平檢測：使用western blot法檢測LC3-Ⅱ, p70s6k, p-p70s6k、p62的蛋白水平。研究結(jié)果1. Aβ誘導SH-SY5Y細胞毒性及其作用機制1.1 Aβ25-35可引起SH-SY5Y細胞存活率下降,并且成一定的劑量和時間依賴性。1.2 A β25-35可誘導SH-SY5Y細胞自噬增強。電鏡下觀察Aβ處理的SH-SY5Y細胞,與對照組相比,細胞內(nèi)的自噬泡數(shù)量增加。5μM、10μM、20μMAβ處理細胞4小時后可以引起細胞內(nèi)LC3-Ⅱ的表達水平增加。1.3 Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞自噬形成增強,不影響自噬泡和溶酶體的結(jié)合。10μMA β處理細胞4小時后,與對照組相比,可以引起細胞內(nèi)MDC標記的酸性膜泡數(shù)量增加,同時細胞內(nèi)p62降解明顯增加。氯喹可抑制自噬泡和溶酶體的結(jié)合過程,引起P62和LC3-Ⅱ表達增加,當Aβ25-35和氯喹合用時,P62和LC3-Ⅱ表達增加進一步增加,說明Aβ25-35誘導自噬泡的形成增加,而不是阻斷自噬泡的降解。1.4 Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞存活率下降與其誘導的自噬增強密切相關。Aβ處理24h后,經(jīng)流式法和Hoechst染色檢測,細胞凋亡沒有明顯增加。利用beclin1 siRNA降低細胞中自噬關鍵因子beclin 1的表達發(fā)現(xiàn),沉默beclin 1的表達可以抑制Aβ誘導的細胞自噬；同時沉默beclin 1的表達可以明顯降低Aβ對SH-SY5Y的細胞毒性。1.5 Aβ25-35誘導的自噬由mTOR信號通路介導。Aβ處理SH-SY5Y細胞4h后,與對照組相比,細胞內(nèi)mTOR的作用底物p70S6K的磷酸化水平降低,P-P70S6K/P70S6K比值降低。2.甲基牛扁亭MLA保護SH-SY5Y細胞拮抗Aβ的細胞毒性及其作用機制2.1 MLA預處理可改善Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞存活率的下降。與對照組相比,5μM、10μM MLA預處理SH-SY5Y細胞可明顯抑制Aβ引起的細胞存活率的降低。同時,我們還觀察到,2.5μM、5μM、10μM、20μM MLA處理細胞后,細胞存活率無明顯改變,說明其有良好的安全性。2.2 MLA預處理可減弱Aβ25-35誘導的自噬。5μ MMLA預處理可減輕10μMA β外源性干預引起的SH-SY5Y細胞內(nèi)LC3-Ⅱ的增加；同時,還可以抑制Aβ引起的細胞內(nèi)MDC標記酸性膜泡數(shù)量的增加。2.3 MLA預處理通過增強mmTOR信號通路,從而抑制A β 25-35誘導的自噬。5μMMLA預處理可拮抗Aβ引起的SH-SYSY細胞內(nèi)mTOR的底物p70S6K的磷酸化水平降低,p-P70S6K/P70S6K比值降低。結(jié)論1.Aβ可以引起SH-SY5Y細胞毒性作用,減少細胞存活率,呈一定劑量和時間依賴性。2.Aβ可以誘導SH-SY5Y細胞自噬增強,主要是通過增強自噬的形成,對自噬成熟過程并沒有明顯影響。3.Aβ引起的SH-SY5Y細胞存活率下降與其誘導的自噬增強密切相關,干擾細胞內(nèi)自噬形成,可減弱Aβ誘導的細胞毒性作用。4.Aβ誘導的SH-SY5Y細胞自噬增強由mTOR信號通路介導。5.MLA可以減輕Aβ引起的SH-SY5Y細胞存活率的下降,對細胞起到保護作用。6.MLA可以減弱Aβ25-35誘導的細胞自噬增強,其作用機制與mTOR信號通路密切相關。
【關鍵詞】：阿爾茨海默氏病 Aβ 自噬 MLA mTOR
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-16
• 縮略詞表16-17
• 前言17-31
• 第一部分 Aβ誘導SH-SY5Y細胞毒性及其作用機制31-53
• 1. 前言31-32
• 2. 材料試劑及主要儀器設備32-34
• 3. 主要試劑配方34-39
• 4. 實驗方法39-44
• 5. 實驗結(jié)果44-46
• 6. 討論46-48
• 附圖48-53
• 第二部分 甲基牛扁亭MLA保護SH-SY5Y細胞拮抗Aβ的細胞毒性及其作用機制53-63
• 1. 前言53-54
• 2. 材料試劑及主要儀器設備54
• 3. 主要試劑配方54
• 4. 實驗方法54-55
• 5. 實驗結(jié)果55-56
• 6.討論56-59
• 附圖59-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-73
• 英文文章73-109
• 致謝109-110
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文110-111
• 附件111

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3 朱文玉;;生長抑素的細胞保護作用及其機制的研究[J];醫(yī)學研究通訊;1994年06期

4 田培燕,鄧祖國;胃腸道的細胞保護[J];黔南民族醫(yī)專學報;1999年04期

5 梁名踐,蔣茨蕾,魯宏,竇志勇,孫敏;新生小牛血清在精制地鼠腎細胞狂犬疫苗組織培養(yǎng)中對腎細胞保護作用的觀察[J];中國媒介生物學及控制雜志;2001年02期

6 張建福;上皮生長因子對胃粘膜的細胞保護作用[J];生理科學進展;1982年03期

7 王志均;消化道的細胞保護[J];北京醫(yī)科大學學報;1990年02期

8 陳長志;王一山;;山莨菪堿的細胞保護作用及其機制[J];上海醫(yī)學;1990年02期

9 燕福生,宋學英,陳致清,張錦楠,閻淑蓮;甘草對人紅細胞保護作用的研究[J];中國中藥雜志;1996年11期

10 王志均;細胞保護與消化道損傷[J];北京醫(yī)學院學報;1985年03期

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1 尚喜雨;丁玉琴;劉萍;;談胃的細胞保護作用[A];中南地區(qū)第六屆生理學學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

2 郭一峰;周文麗;張建鵬;劉軍華;馮偉華;焦炳華;;海螵蛸多糖對小鼠胃黏膜細胞保護作用的研究[A];2008年全國糖生物學學術(shù)會議論文摘要[C];2008年

3 魏錫云;張錦;陳肅標;孫勁旅;;扶正中藥對小鼠免疫細胞保護作用的形態(tài)定量分析[A];第五屆全國生物醫(yī)學體視學學術(shù)會議、第八屆全軍軍事病理學學術(shù)會議、第四屆全軍定量病理學學術(shù)會議論文匯編[C];2002年

4 初亮;邵薈竹;王帥;周琴;劉克辛;姚繼紅;;槲皮素對HepG2細胞二相酶的誘導及細胞保護作用的研究[A];第九屆全國藥物和化學異物代謝學術(shù)會議論文集[C];2009年

5 吳迪;閔偉;駱丹;;黃芩苷對UV損傷皮膚細胞保護作用的蛋白質(zhì)組學研究[A];中華醫(yī)學會第十五次全國皮膚性病學術(shù)會議論文集[C];2009年

6 謝建瓊;方琴;王季石;胡秀英;崔欣;;人DNA修復基因MGMT導入NK細胞增強其抗藥特性[A];貴州省2008年血液學年會論文匯編[C];2008年

7 范黎黎;尹蔚蘭;唐小卿;;H2S對MPP~+損傷PC12細胞的拮抗作用及其機制[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年

8 陳曉宇;席加喜;;血栓通對順鉑損傷HK-2細胞保護作用及其機制的研究[A];2013年中國藥學大會暨第十三屆中國藥師周論文集[C];2013年

9 曹莉;尹鴻操;周禮;王擁軍;;氧化型低密度脂蛋白致PC12細胞的毒性作用[A];全國第三屆心腦血管疾病學術(shù)會議論文集[C];2003年

10 閔偉;駱丹;;黃芩苷對紫外線輻射損傷人表皮細胞保護作用的差異蛋白質(zhì)組學研究[A];2009全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學術(shù)會議論文匯編[C];2009年

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1 本報記者 王丹;在圍術(shù)期心腦保護領域書寫歷史[N];健康報;2012年

2 王建高;留學長才干報國正當時[N];科技日報;2004年

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7 馮利杰;Tau蛋白介導的細胞毒性及泛素連接酶Hrd1的保護作用[D];安徽醫(yī)科大學;2007年

8 馬晨曦;重金屬對HeLa細胞中熱激蛋白70（HSP70）表達的影響[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2013年

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10 李玉娟;ADMA對MPP~+損傷PC12細胞的拮抗作用及機制[D];南華大學;2010年

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本文編號：1085679