發(fā)布時(shí)間：2017-10-17 10:10

  本文關(guān)鍵詞：孕酮抑制Aβ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化所致神經(jīng)元損傷

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【摘要】：目的：阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是人類最常見的年齡相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是癡呆中最普遍的一種形式。其主要病理學(xué)變化包括：β淀粉樣蛋白（β-amyloid,Aβ）沉積形成老年斑（senile plaque, SP）、神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles, NFTs）、突觸缺失、神經(jīng)元變性死亡以及星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化和增生等。星形膠質(zhì)細(xì)胞在AD的發(fā)生與發(fā)展過程中具有雙刃劍的作用，適度激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可胞吞Aβ蛋白，釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，保護(hù)神經(jīng)元，緩解AD的病理進(jìn)展，但過度激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過釋放神經(jīng)毒性的細(xì)胞因子和其他毒性物質(zhì)，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。神經(jīng)甾體（neurosteroid）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中甾體類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的總稱，主要由膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元合成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮廣泛作用。研究顯示，在多種神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)甾體水平發(fā)生明顯變化，尤其AD患者腦脊液中PROG及AP水平與正常同齡人相比顯著下降。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)在AD病理模型中，大鼠神經(jīng)元的神經(jīng)甾體合成代謝發(fā)生明顯變化，但是在AD病理模型下，星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體的合成代謝，，以及神經(jīng)甾體對星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元交互作用中的影響尚未研究。因此本研究使用β淀粉樣蛋白構(gòu)建AD樣細(xì)胞模型，檢測Aβ活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞合成代謝神經(jīng)甾體的變化，進(jìn)而確定與其活化關(guān)系密切的神經(jīng)甾體，并闡述神經(jīng)甾體對Aβ活化膠質(zhì)細(xì)胞的影響，及其在膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元交互作用中的影響。本研究為神經(jīng)甾體在AD防治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1細(xì)胞培養(yǎng) 1.1大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 取新生Spague-Dawley（SD）大鼠，無菌條件下取大腦皮質(zhì)，剪碎，37℃水浴中胰酶消化15-20min，含10%FBS的高糖Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium（DMEM）終止消化。使用巴氏吸管吹散細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，每隔2-3d全量更換培養(yǎng)液至細(xì)胞基本融合。使用‘二次震蕩法’純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP免疫熒光染色結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞純度超過95%。純化后星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)消化、重懸，以1×105個(gè)/mL密度接種于孔板中，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)。 1.2大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng) 取新生24h內(nèi)SD大鼠大腦皮質(zhì)，胰蛋白酶消化輔以機(jī)械分離法分離細(xì)胞，懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的玻片上，在37oC，5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，6h后首次換液為含2%B27的neurobasal培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，48h以后完全換液，此后每兩天半量換液。取培養(yǎng)6-7d的神經(jīng)元細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。 1.3星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng) 星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的共培養(yǎng)參照文獻(xiàn)方法略有改進(jìn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于處理過的六孔板中，每個(gè)孔底部含有4個(gè)約2mm高的石蠟小柱，用于支撐載玻片；神經(jīng)元培養(yǎng)在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載破片上，培養(yǎng)7天后，將載有神經(jīng)元的玻片放入經(jīng)不同藥物處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液為DMEM（不含Aβ、PROG），繼續(xù)培養(yǎng)48h。 2實(shí)驗(yàn)分組與給藥 2.1Aβ1-42處理對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化 星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)不同濃度的Aβ1-42處理，隨機(jī)分為Control、AβL（1μM）、AβM（5μM）、AβH（10μM）四組，處理24h，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，檢測炎癥因子的釋放。 2.2Aβ1-42處理對星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體水平的影響 星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)膽固醇和Aβ1-42處理，隨機(jī)分為空白組、Control組（膽固醇底物組，膽固醇濃度為10μM）、Aβ組（膽固醇+Aβ1-42，膽固醇和Aβ1-42濃度分別為10μM和5μM），處理24h，檢測神經(jīng)甾體的水平。 2.3PROG處理對Aβ1-42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響 星形膠質(zhì)細(xì)胞分別加入不同濃度PROG（0，0.01μM，0.1μM，1μM）與Aβ1-42（5μM），隨機(jī)分為Control、Aβ、PL、PM、PH五組，共同處理24h，用于檢測炎癥因子的釋放、NF-κB的活性及與神經(jīng)元共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。3GFAP標(biāo)記免疫熒光染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài) 通過對GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性中間纖維蛋白）免疫熒光染色，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。各組細(xì)胞加藥處理后，取出細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，兔源GFAP（1:1000）4℃孵育過夜，二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。 4ELISA測定星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1β和TNFα的水平 取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，3000rpm離心，取上清，按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。 5HPLC-MS法測定星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體水平 取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，加入內(nèi)標(biāo)甲睪酮，用乙酸乙酯/正己烷萃取，合并有機(jī)相，50℃水浴下氮?dú)獯蹈桑?0℃水浴中2-硝基-4-三氟甲基苯肼（2NFPH）衍生化40min，采用HPLC-MS技術(shù)測定孕烯醇酮（pregnenolone, PREG）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA）、孕酮（progesterone, PROG）和別孕烯醇酮（allopregnanolone,AP）的含量。 6星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB活性的檢測 6.1免疫熒光法 通過觀察免疫熒光染色的NF-κB主要功能性亞單位p65在細(xì)胞中的定位，反應(yīng)NF-κB的活性。取各處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30min，兔源p65（1:100）4℃孵育過夜，二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。 6.2Western Blot分析 通過Western Blot檢測p65在細(xì)胞核中的表達(dá)，反應(yīng)NF-κB的活性。取分組加藥處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞，冰上收集細(xì)胞，提取細(xì)胞核蛋白，-80℃，備用。等量蛋白提取液與上樣緩沖液混合，煮沸變性。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，100mA濕轉(zhuǎn)，脫脂奶粉封閉，加兔源p65（1:1000）孵育過夜，TBS漂洗后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，ECL光化學(xué)法顯色，暗室中壓X光片顯影。X-光膠片經(jīng)掃描，應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件對掃描圖上的條帶進(jìn)行相對定量分析。 7MTT法檢測神經(jīng)元存活率 取出神經(jīng)元細(xì)胞爬片，放入24孔板中，每孔加入40μL MTT（5mg·mL-1），于37℃孵育4h，棄去培養(yǎng)基，每孔各加入300μL DMSO，混合均勻，酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞490nm波長處的吸光度（OD值），以各組細(xì)胞吸光度與對照組吸光度的比值表示相對細(xì)胞存活率。 結(jié)果： 1Aβ1-42對星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 GFAP標(biāo)記的免疫熒光染色，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。熒光顯微鏡下可見，對照組的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體飽滿，扁平，胞漿豐富，Aβ低劑量組胞體有輕微回縮，中劑量組胞體回縮，突起延展，高劑量組細(xì)胞突起明顯增多，延伸，細(xì)長，呈星形放射狀。說明Aβ1-42處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。 2Aβ1-42對星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，AβM和AβH組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β水平均顯著升高（P0.05），AβL、AβM和AβH組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNFα的水平均顯著升高（P0.05）。結(jié)果顯示Aβ1-42可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放。 3Aβ1-42對星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體水平的影響 HPLC-MS法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ1-42處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體PROG水平下降43.8%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P0.05），而PREG和DHEA水平均未見顯著變化（P0.05）。 4PROG對活化星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，Aβ組星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液中IL-1β和TNFα釋放均顯著升高（P0.01）；與Aβ組相比，PM組、PH組IL-1β和TNFα的釋放均顯著下降（P0.05）；PL組IL-1β和TNFα的水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P0.05）。結(jié)果顯示孕酮能夠濃度依賴的抑制Aβ引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放。 5PROG對Aβ1-42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB活性的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，NF-κB的主要功能亞單位p65在正常對照組細(xì)胞的胞質(zhì)明顯表達(dá)，胞核無著色；Aβ組NF-κB被激活，表現(xiàn)為p65核轉(zhuǎn)位，可見胞核深染，感光強(qiáng)。孕酮和Aβ1-42共同處理24h，隨孕酮濃度的增加，p65在細(xì)胞核中的分布逐漸減少，胞質(zhì)中分布增多，孕酮濃度依賴的抑制Aβ1-42引起p65的核轉(zhuǎn)位。 Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ組星形膠質(zhì)細(xì)胞核提取液中p65的表達(dá)顯著增加（P0.01），孕酮處理有效抑制Aβ1-42引起的p65核轉(zhuǎn)位，與Aβ組相比，中、高劑量組細(xì)胞核提取液中p65表達(dá)量顯著降低（P0.01），低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。結(jié)果表明,孕酮濃度依賴的抑制Aβ1-42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的活性 6孕酮抑制Aβ活化星形膠質(zhì)細(xì)胞所致神經(jīng)元損傷 MTT結(jié)果顯示，Aβ活化星形膠質(zhì)細(xì)胞組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著下降，為對照組的70.1%（P0.05）。孕酮抑制Aβ活化星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的神經(jīng)元存活率下降，作用呈濃度依賴性。與Aβ組相比，孕酮中、高劑量組神經(jīng)元存活率顯著升高，分別為Aβ組的115.9%和129.6%（P0.05）。 結(jié)論： 1Aβ1-42處理濃度依賴的激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)為：1）胞體回縮、突起伸長，呈星形放射狀；2）炎癥因子IL-1β和TNFα釋放水平升高；3）激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。 2Aβ1-42處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞可使其神經(jīng)甾體孕酮水平顯著下降，表明Aβ1-42可影響神經(jīng)甾體的水平。 3孕酮能濃度依賴的抑制Aβ1-42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放和NF-κB信號(hào)通路的激活，說明孕酮可以有效的抑制Aβ1-42對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。 4Aβ1-42活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元具有損傷作用，孕酮濃度依賴的抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化所致神經(jīng)元損傷。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 β-淀粉樣蛋白 神經(jīng)甾體 星形膠質(zhì)細(xì)胞 孕酮 TNFα IL-1β NF-κB 神經(jīng)保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮寫15-16
• 引言16-18
• 第一部分 Aβ1-42對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用18-35
• 前言18-19
• 材料與方法19-23
• 結(jié)果23-25
• 附圖25-27
• 附表27-29
• 討論29-31
• 小結(jié)31
• 參考文獻(xiàn)31-35
• 第二部分 孕酮抑制 Aβ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化所致神經(jīng)元損傷35-52
• 前言35-36
• 材料與方法36-40
• 結(jié)果40-41
• 附圖41-45
• 附表45-46
• 討論46-47
• 小結(jié)47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 結(jié)論52-53
• 綜述53-64
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 致謝64-65
• 個(gè)人簡歷65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 Sha Liu;Honghai Wu;Gai Xue;Xin Ma;Jie Wu;Yabin Qin;Yanning Hou;;Metabolic alteration of neuroactive steroids and protective effect of progesterone in Alzheimer's disease-like rats[J];Neural Regeneration Research;2013年30期

2 沈維高;何欣;王振江;;星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)功能及其與疾病的關(guān)系研究進(jìn)展[J];北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年06期

3 李新娟;何瑞芳;李爽;李曉娟;李東亮;;孕酮對全腦缺血/再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬P2X_7受體表達(dá)的影響[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2012年05期

本文編號(hào)：1048239